Nanocuerpos conjugados con oro en una señal. - Grupo de banco de carga Co., Ltd

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 10643 (2023) Citar este artículo

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A pesar de que la COVID-19 pasó de la pandemia al control, todavía nos encontramos en un estado de incertidumbre sobre el éxito a largo plazo. Por lo tanto, existe una gran necesidad de diagnósticos rápidos y sensibles para mantener el estado de control. Después de varias pruebas de optimización, desarrollamos tiras de prueba de flujo lateral (LFT) para la detección rápida del antígeno pico 1 (S1) del SARS-CoV-2 en muestras de saliva. Para mejorar la señal de nuestras tiras desarrolladas, aplicamos conjugados de oro duales. Se emplearon nanocuerpos anti-S1 (Nbs) marcados con oro como conjugado detector de S1, mientras que la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) marcada con oro se utilizó como conjugado de captura de S1. En un diseño de tiras paralelas, utilizamos un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-S1 como detector de antígeno en lugar de Nbs anti-S1. Se recolectaron muestras de saliva de 320 sujetos sintomáticos (180 casos positivos confirmados por RT-PCR y 140 casos negativos confirmados) y se analizaron con las tiras desarrolladas. En la detección temprana de muestras positivas con umbral de ciclo (Ct ≤ 30), las tiras LFT basadas en Nbs mostraron mayor sensibilidad (97,14%) y especificidad (98,57%) que las tiras basadas en mAb que dieron una sensibilidad del 90,04% y una especificidad del 97,86%. Además, el límite de detección (LoD) para partículas de virus fue menor para la LFT basada en Nbs (0,4 × 104 copias/ml) que para la prueba basada en mAb (1,6 × 104 copias/ml). Nuestros resultados favorecen el uso de conjugados duales de oro Nbs y ACE2 en tiras LFT. Estas tiras de señal mejorada ofrecen una herramienta de diagnóstico sensible para la detección rápida del antígeno S1 del SARS-CoV-2 en muestras de saliva fácilmente recolectadas.

La actual pandemia de COVID-19, causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), es una de las pandemias más desafiantes de la historia1. El control de la propagación del SARS-CoV-2 depende en gran medida de una detección temprana y precisa de los casos infectados2. Después del brote de COVID-19, se desarrollaron y aplicaron ampliamente kits de RT-PCR para el diagnóstico clínico de la infección por SARS-CoV-2. A pesar de su alta sensibilidad y especificidad, las técnicas de ácidos nucleicos tienen sus limitaciones en términos de costo, eficiencia de tiempo, sofisticación y grado de contaminación3,4. Además, los resultados falsos negativos de las pruebas eran una desventaja importante5. El desarrollo de pruebas rápidas y sensibles en el punto de atención (POCT) fue una demanda para controlar la pandemia6,7. Las pruebas de antígenos son una de las herramientas de diagnóstico más útiles para los enfoques de detección en toda la población8. Estas pruebas son un reflejo directo de la infección activa en lugar de pruebas de flujo lateral basadas en anticuerpos9. Los anticuerpos monoclonales (mAb) se aplican con éxito en el desarrollo de diferentes sistemas de diagnóstico basados en antígenos, pero su estructura compleja y de gran tamaño afecta a su tolerabilidad10. Los nanocuerpos (Nbs) son fragmentos recombinantes, específicos de antígeno, de dominio único y variables de anticuerpos de cadena pesada de camélidos únicamente. A diferencia de los anticuerpos convencionales, los nanocuerpos contienen un único dominio variable (VHH) y dos dominios constantes (CH2 y CH3). Los Nbs clonados y aislados poseen propiedades únicas que les permiten sobresalir en los anticuerpos convencionales11. Los Nbs son muy robustos, fáciles de fabricar, más estables y tienen la capacidad de reconocer epítopos ocultos o poco comunes. Los Nbs podrían conservar todo su potencial de unión al antígeno tras su aislamiento y se han empleado de manera eficiente en diversas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas12.

Los nanomateriales proporcionan sitios de unión adicionales para los anticuerpos de detección, lo que conduce a una mejora de la intensidad de la señal en los ensayos de diagnóstico13. Entre los periodistas de color, las nanopartículas de oro, con alta intensidad de color, podrían aumentar la sensibilidad de LFT14. Además, otras características de las nanopartículas de oro, como la rentabilidad, la facilidad de producción, la estabilidad en forma seca y la fácil conjugación con biomoléculas, las convierten en candidatas ideales para usar como reporteros de señales en aplicaciones industriales15. En nuestro trabajo anterior de Kamel et al., 2022, empleamos Nbs conjugado con oro en ELISA sándwich para la detección del antígeno S1 del SARS-CoV-2 en saliva e hisopos nasofaríngeos. Los resultados fueron muy interesantes al mejorar la sensibilidad de detección precoz del test en un 93,3%16.

La entrada del SARS-CoV-2 en las células huésped está mediada por la interacción entre la subunidad de la proteína Spike (S), el dominio de unión al receptor (RBD) y los receptores de la célula huésped humana. Uno de los principales receptores de la superficie celular es la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), que se une con gran afinidad al SARS-C0V-217,18.

El hisopo nasofaríngeo es el método recomendado para la recolección de muestras del tracto respiratorio superior para las pruebas de diagnóstico de COVID-19. Varios inconvenientes, entre ellos el malestar del paciente, el dolor de cabeza o el sangrado nasal intenso, principalmente en pacientes trombocitopénicos, podrían limitar el uso de hisopos, especialmente en programas de monitorización seriada o de pruebas masivas19. Por otro lado, el uso de saliva o esputo representa una forma fácil, rápida e indolora de tomar muestras, lo que permite realizar pruebas generalizadas. Además, diferentes estudios indicaron que la sensibilidad y especificidad de la saliva para el diagnóstico de COVID-19 es similar a la de los hisopos nasofaríngeos20,21.

En este estudio, empleamos conjugados de oro duales para mejorar la señal de las tiras LFT. Au-Nbs actuó como sonda detectora y Au-ACE2 actuó como sonda de captura, permitiendo una medición sensible del antígeno S1 intercalado entre ellos. Estas tiras LFT proporcionan un método sensible, rápido y no invasivo para la detección de la proteína de pico (S1) del SARS-CoV-2 en muestras de saliva de pacientes con COVID-19, lo cual es importante para la prevención y el control de la propagación de la enfermedad entre la población.

El ácido cloroáurico (HAuCl4), la albúmina sérica bovina (BSA), la sacarosa (C12H22O11) y el carbonato de potasio (K2CO3, ≥ 99,0%), la leche desnatada, se adquirieron en Sigma Aldrich, MO, EE. UU. Glicoproteína S1 de pico del coronavirus humano recombinante SARS-CoV-2 (ab 288546), anticuerpos anti-SARS-CoV-2 recombinantes (ab 281311), enzima convertidora de angiotensina recombinante 2 (ACE2) (ab151852), todos de Abcam, Cambridge, Reino Unido . Proteína recombinante del SARS-CoV (MBS569928), antígeno MERS CoV pico S1 (MBS434229) de MyBioSource, California, EE. UU., nanocuerpos del SARS-CoV-2 S1 (AssayGenie, Dublín, Irlanda), kit de sustrato Pierce DAB (n.º de catálogo 34002, Thermo Fisher EE.UU.). Se adquirieron de Merch Millipore (Darmstadt, Alemania) una almohadilla de muestra y una almohadilla de absorción (n.º de cat. CFSP173000), una almohadilla de conjugado de fibra de vidrio (n.º de cat. GFDX103000) y una membrana de nitrocelulosa (NC) de alto flujo (n.º de cat. HF09002XSS). Espectrofotómetro UV-Vis (Thermofisher-USA). Dispensador manual (Nanomat 4-CAMAG-laborto), medidor de PH (Jenway 3510, Reino Unido), centrífuga de alta velocidad (Eppendorf, 5430R, Alemania). El agua ultrapura utilizada en todo el estudio se generó a partir de un sistema de purificación de agua Millipore Milli-Q (Billerica, MA, EE. UU.). Sistema de documentación de geles (Gel Doc XR+) (Biorad, EE. UU.) y análisis de datos mediante el software “Image lab”. Microscopio electrónico de barrido JEOL JSM5200, Japón.

Se recogieron muestras de saliva de 320 personas (hombres y mujeres con una edad promedio de 35 a 65 años) con síntomas de COVID-19 (fiebre, tos, dolor de huesos, diarrea, dolor de cabeza, dolor de garganta, erupción cutánea, pérdida del gusto o del olfato). , dificultad para respirar, dolor o presión en el pecho) en la clínica ambulatoria de COVID-19 de TBRI (junio de 2021 a abril de 2022), siguiendo las pautas de la OMS. Utilizando un sistema de transporte viral universal (UVS), los hisopos nasofaríngeos se colocaron en un medio de transporte viral (volumen total de 3 ml), se sellaron de forma segura y se enviaron para pruebas de RT-PCR. El paciente recogió muestras de saliva no estimuladas temprano en la mañana. Se pidió a los pacientes que se lavaran la boca con agua y luego escupieran repetidamente en vasos esterilizados, que se cerraron de forma segura y se conservaron rápidamente a -80 °C hasta su uso.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación (REC) del Instituto de Investigación Theodor Bilharz (TBRI) (PT 623, 2021). Los sujetos humanos en este estudio fueron inscritos de acuerdo con los estándares éticos de REC-TBRI y la Declaración de Helsinki de 1964. Se obtuvieron formularios de consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

Las AuNP (40 nm) se prepararon con éxito mediante el método de reducción química. El protocolo fue adoptado de Frens et al.22 con ligeras modificaciones según Borse y Konwar23. Las partículas sintetizadas se comprobaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) y microscopio electrónico de transmisión (TEM). Los métodos de síntesis detallados y los resultados de caracterización se presentan en la Información complementaria electrónica (ESI).

ACE2 se adsorbió pasivamente a AuNP (probamos la conjugación covalente para ACE2 pero la absorción pasiva mostró mejores resultados de prueba cuando se aplicó a las tiras reactivas), mientras que Nbs y mAb se conjugaron covalentemente a AuNP. Antes de la conjugación pasiva de ACE2 con nanopartículas de oro, las condiciones de optimización (pH y concentración de proteínas) se ajustaron mediante una prueba de agregación de sales. Se probaron diferentes concentraciones de proteína ACE2 (10, 20, 30, 40 y 50 µg/ml) con condiciones de pH en serie (5,5 a 10) de AuNP. Se añadieron 10 µl de una solución de NaCl al 10% después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente (RT). El mejor valor de pH, así como la concentración óptima de proteína para la conjugación con oro coloidal, se eligieron basándose en la ausencia visual de agregación después de la adición de sales. Tras el ajuste de las condiciones, se realizó la conjugación mediante procedimientos de adsorción pasiva según Tanaka et al.24. Brevemente, se agregaron 200 µl de 50 µg/ml de ACE2 a 1,8 ml de solución de AuNPs (pH 9) y se mezclaron inmediatamente. Las mezclas se mantuvieron durante 2 h a temperatura ambiente con agitación vigorosa, luego se agregaron 200 µl de BSA al 10 % (p/v) (en solución de KH2PO4 50 mM, pH 9,0) para bloquear la superficie de AuNP no recubiertas, seguido de centrifugación (5000 rpm durante 15 min a 4 °C). Luego, el sedimento que contenía bioconjugados de oro se resuspendió usando 2 ml de solución conservante (BSA al 1% (p/v), 0,05% y tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,2) y se mantuvo a 4 °C en botellas oscuras. hasta que se use. La conjugación covalente de AuNP con Nbs o mAb se llevó a cabo utilizando el kit de conjugación de oro (ab154873, Abcam-UK) según el protocolo del fabricante. Los bioconjugados de oro producidos se verificaron mediante espectroscopia de absorción ultravioleta y visible (espectroscopia UV-Vis) como se representa en ESI.

El ensayo de transferencia puntual se realizó para probar si los Nbs, los mAb y ACE2 conservan su funcionalidad (unión al antígeno) después de la conjugación con AuNP o no. Además, el ensayo evaluaría la intensidad de la reacción entre el antígeno S1 y las proteínas sometidas antes y después de la conjugación con nanopartículas de oro. El ensayo dot-blot se realizó según Gossen et al.25 con algunas modificaciones. Brevemente, se detectó 1 µg de antígeno del SARS-CoV-S1 en una membrana de nitrocelulosa (NC) y se secó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se bloquearon durante 90 min con 2 ml de leche desnatada al 3%. Se incubaron 200 µl de concentraciones previamente optimizadas (50, 30 y 50 µg/ml) para Nbs, mAb y ACE2 respectivamente durante 30 minutos con AuNP de 40 nm en un volumen final de 2 ml. Se aplicaron 10 µl/punto de cada solución de proteína conjugada sobre las membranas y se dejaron secar durante 2 h a temperatura ambiente, luego las membranas se lavaron con PBS (0,01 M, pH 7,4) que contenía dodecilsulfato de sodio (0,1 p/v) y se mantuvieron durante la noche a RT. Como control positivo, también se incubaron los Nbs y mAb libres o ACE2 en la transferencia de antígeno. Al día siguiente, se administraron 10 µl de conjugado anti-IgG-HRP humana (1:1000) para ACE2, IgG-HRP anti-conejo (1:20 000) para mAb e IgG-HRP anti-llama (1:10 000) para Nbs. manchado e incubado durante 1 h a temperatura ambiente. La señal se desarrolló utilizando el kit de sustrato Pierce DAB. Como control negativo, se aplicaron partículas adsorbidas de BSA al 1% mientras que las AuNP desnudas sirvieron como controles de fondo.

Este LFT tipo sándwich se ensambló para la detección del antígeno S1 del SARS-CoV-2 en muestras de saliva. Se usaron AuNPs-Nbs o AuNPs-mAb como sondas detectoras en la almohadilla de conjugado, mientras que AuNPs-ACE2 se usó como sonda de captura en la línea de prueba. Si la muestra contiene el antígeno S1 del SARS-CoV-2, las AuNPs-Nbs o AuNPs-mAb lo detectarán en la almohadilla conjugada y luego el complejo migrará a las AuNPs-ACE2 unidas a la membrana en la línea de prueba para formar la señal. complejo inmunológico mejorado. Los conjugados no unidos continuarán fluyendo hacia adelante, uniéndose al anticuerpo anti-llama en la línea de control y volviéndolo rojo. Una línea de control de color es la marca de validez de la tira revelada, sin embargo, los resultados de la detección fueron negativos o positivos.

La estructura de la tira LFT con señal mejorada desarrollada se presenta en la Fig. 1. Se compone de cuatro partes: una almohadilla de muestra, una almohadilla de conjugado, un NC de alto flujo y una almohadilla de absorción. Después de varios pasos de optimización, las tiras reactivas se ensamblaron dispensando los componentes de la línea de prueba y de la línea de control en la membrana NC. El intervalo entre las dos líneas fue de 4 mm. Después de eso, la membrana NC se bloqueó con un tampón de bloqueo y se secó a temperatura ambiente durante 1 h. Se pulverizaron AuNPs-Nbs o AuNPs-mAb sobre la almohadilla conjugada tratada y se dejaron secar durante 1 h a 37 °C. La almohadilla de conjugado se pegó superponiendo 2,4 mm con la membrana NC, mientras que la almohadilla de muestra se superpuso 3 mm con la almohadilla de conjugado. La almohadilla absorbente se pegó en el otro lado del NC. Toda la tira ensamblada tenía unas dimensiones de 4 × 70 mm. Las tiras reactivas preparadas se almacenaron en una bolsa sellada a temperatura ambiente hasta su uso.

Representación esquemática del principio LFTS sándwich mejorado para la detección del antígeno S1 del SARS-CoV-2 en muestras de saliva.

Almohadilla de conjugado: La almohadilla de conjugado se trató con Triton X-100 al 0,1 % y se dejó secar a temperatura ambiente. Diferentes volúmenes de AuNps-Nbs o AuNPs-mAb (5, 6,…10 μl/tira) en un tampón estabilizante (solución de sacarosa al 20% previamente diluida con tampón dihidrogenofosfato de potasio 50 mM (pH 7,5) y 20 μl de 2-propanol , Se prepararon Cada concentración se roció sobre una almohadilla de conjugado pretratada, seguido de una incubación durante 1 hora a 37 °C en una estufa de vacío.

Proteínas de la línea de prueba y control: se probaron diferentes volúmenes (3, 5, 10 μl/tira) de ACE2-AuNP (línea de prueba), así como IgG antillama (3 y 5 μl de 1 y 2 mg/ml) por tira. para la línea de control. Concentraciones óptimas donde se seleccionó un color rojo distintivo de control y línea de prueba, luego de analizar las mismas muestras en las mismas condiciones.

Bloqueo de membrana NC: Se probaron diferentes concentraciones de solución bloqueadora de leche desnatada (1, 0,5 y 0,3%) y diferentes tiempos de inmersión (10, 15 y 20 min).

Volumen y preparación de la muestra: Se probaron diferentes volúmenes de muestras de saliva, aplicadas como tales o diluidas en tampón de muestra (NaCl 250 mM, Tris HCl 10 mM y BSA 200 µg/ml), para determinar las condiciones óptimas para una reactividad máxima de LFT.

La caracterización de la superficie de la tira reactiva para garantizar el establecimiento de sondas conjugadas en la membrana NC se realizó mediante SEM y AFM26. Se utilizó JEOL JSM5200 –SEM para caracterizar la tira reactiva NC y la almohadilla de conjugado antes y después de la carga de las sondas conjugadas, así como la línea de prueba antes y después de la carga de la muestra en presencia del antígeno S1. El AFM se llevó a cabo mediante un instrumento AFM modelo 5600L fabricado por Agilent Technology, EE. UU. Los análisis se realizaron en modo tapping en diferentes tamaños, utilizando modos de contraste de fase y altura. Se obtuvieron al menos seis imágenes de diferentes zonas y se seleccionaron las mejores imágenes representativas. Las imágenes se procesaron con el paquete de software de análisis e imágenes PicoView 1.5 de Agilent.

El límite de detección (LoD) del SARS-CoV-2 irradiado γ se midió utilizando nuestras tiras desarrolladas para determinar su sensibilidad. El LoD de los virus se obtuvo mediante el uso de diluciones en serie de SARS-CoV-2 irradiado γ (2,7 × 105 copias/ml) (hcov-19/Egypt/NRC-03/2020-SARS-CoV2 cepa (GIS) Acceso a la AID#EPI -ISI-430819). Esta cepa fue amablemente donada por el Centro de Excelencia Científica para el Virus de la Influenza, División de Investigación Ambiental, Centro Nacional de Investigación de Egipto. La especificidad de las tiras LFT se confirmó mediante pruebas de su reactividad contra dos antígenos de pico diferentes relacionados con la corona (SARS-CoV S1 y MERS-CoV S1), que se prepararon en el tampón de muestra. Se probó la estabilidad de almacenamiento de las tiras reactivas desarrolladas a diferentes temperaturas (a 4 °C, temperatura ambiente y 37 °C) y tiempos periódicos (1 y 2 meses). Se utilizaron y probaron tres casos de control positivos y tres negativos mediante tiras almacenadas, y las intensidades de la línea de prueba se registraron y representaron gráficamente frente al tiempo y las condiciones de almacenamiento.

Las tiras desarrolladas analizaron muestras de saliva de 320 casos confirmados por RT-PCR, 180 casos positivos (con diferentes valores de Ct) y 140 casos negativos (Fig. S5). La intensidad del color (como volumen × 105) de la línea de prueba producida se leyó mediante un sistema de documentación en gel (Gel Doc XR+) (Biorad, EE. UU.), utilizando el software Image Lab.

La técnica de tira mejorada se evaluó utilizando RT-PCR como prueba de referencia basada en las siguientes medidas de precisión: sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo y estadística kappa de Cohen (κ). Se estimó el valor Kappa para determinar el nivel de concordancia entre la prueba PCR y la técnica estudiada. El nivel de acuerdo se determinó según la siguiente escala (Landis y Koch27).

valor k

Nivel de acuerdo

Pobre

0,01–0,2

Leve

0,21–0,4

Justo

0,41–0,60

Moderado

0,61–0,80

Sustancial

0,81–1

Casi perfecto

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete de software analítico (IBM-SPSS) versión 23. La curva característica operativa del receptor (ROC) se construyó para probar las características del ensayo de tira mejorada. Para la prueba de estabilidad, se utilizó la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) post hoc para ilustrar las diferencias estadísticas entre los diferentes intervalos de tiempo. Se aplicó el análisis de regresión para estimar la relación entre la intensidad y el tiempo a diferentes temperaturas. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson (r) para correlacionar el tiempo con la intensidad medida.

La imagen TME de AuNP (Fig. 2) mostró una buena uniformidad y dispersión de las partículas preparadas con un tamaño promedio de 40 nm, mientras que los resultados del potencial zeta (Fig. S1) confirmaron partículas estables fuertemente aniónicas que son adecuadas para la conjugación con proteínas.

Imagen TEM de nanopartículas de oro coloidal de forma esférica de 40 nm ± 4 nm.

Según Oliver28, el etiquetado eficaz de AuNP con diversas proteínas requiere condiciones optimizadas, incluido el pH y la concentración de proteínas28. Las condiciones óptimas para la conjugación de ACE2 con AuNP mediante adsorción pasiva se obtuvieron utilizando una concentración de 50 µg/ml, a pH 9 en temperatura ambiente, donde no se obtuvo agregación de sales. Se realizó una conjugación covalente eficiente para mAb y Nbs con nanopartículas de oro. Los conjugados preparados se verificaron mediante espectrofotómetro UV-vis que muestra un ligero cambio en los espectros de absorción (525–532 nm) al probar proteínas conjugadas con oro en comparación con las libres, como se muestra en SEI (Figs. S2-S4).

Como se muestra en la Fig. 3 y en la Tabla 1, todas las proteínas conjugadas y no conjugadas produjeron un color marrón con diferentes grados de intensidad. Además, se observó un color marrón más oscuro con las proteínas conjugadas en comparación con las correspondientes no conjugadas. El color marrón más potente (la intensidad más alta) se observó con las Nbs-AuNP, lo que indica que tenían la reactividad más fuerte contra el antígeno SARS-CoV-2.

Ensayo de transferencia de puntos. Los puntos conjugados con oro (primeros tres puntos en bruto 1) representan los Nbs, ACE2 y mAb conjugados con oro (puntos marrón oscuro) respectivamente, seguidos del control negativo (BSA). Los primeros tres puntos de color (marrón claro) en el crudo 2 representan las proteínas no conjugadas, mientras que el último punto representa el blanco (nanopartículas de oro solas).

Se probaron diferentes condiciones de optimización para obtener la versión más eficiente y estable de la tira desarrollada:

Tratamiento de la almohadilla conjugada: La primera condición aplicada fue el pretratamiento de la almohadilla conjugada usando tampón estabilizador de sacarosa, que sirve como agente de resolubilización y conservante. Esto se realizó para mantener la funcionalidad de las partículas del detector y la consistencia de la liberación del conjugado, que son esenciales para todas las LFT29.

Concentraciones óptimas de los reactivos aplicados en la tira LFT: para los reactivos de la almohadilla conjugada, se seleccionaron 5 y 8 μl/tira de AuNPs-Nbs o AuNPs-mAb respectivamente, mientras que 5 μl de AuNPs-ACE2 en la línea de prueba y 1 Se eligieron mg/ml de IgG anti-llama en la línea de control.

El tampón de bloqueo óptimo: para la membrana NC fue 0,3% de leche desnatada en tampón de ácido bórico 50 mM (pH 8,5), con inmersión en tira durante 20 min (Fig. 4).

Condiciones de muestreo: 30 μl de saliva diluida con tampón de muestra (1:1).

Optimización del tampón de bloqueo y condiciones para una tira mejorada basada en el tampón de bloqueo y el tiempo de inmersión para la misma muestra de prueba, (A) ácido bórico 50 mM y leche desnatada al 0,3% y 15 min. tiempo de inmersión, (B) ácido bórico 50 mM y leche desnatada al 0,3% y tiempo de inmersión de 20 min), (C) ácido bórico 50 mM y leche desnatada al 0,3% y tiempo de inmersión de 10 min. (A) Mostró la línea de control y prueba más identificada (color rojo más fuerte).

AFM y SEM son técnicas ampliamente utilizadas para el análisis morfológico de diferentes tipos de superficies. Imágenes de AFM, como se muestra en las figuras 5A-E, que representan las morfologías de la membrana NC y la almohadilla conjugada utilizadas en la construcción de la tira LFT, antes y después de la carga de proteínas conjugadas con oro (Nbs y ACE2), así como la modificación después. carga de muestra. La morfología de la superficie más suave del NC desnudo se muestra en la Fig. 5A. La caracterización morfológica de la almohadilla conjugada se muestra en las figuras 5B y C antes y después de la carga de AuNPs-Nbs respectivamente. La almohadilla conjugada desnuda mostró una estructura de 0,46 μm, mientras que se observó un aumento en la altura después de la carga de los nanocuerpos conjugados con oro con una estructura de 1,3 μm. La Figura 5D muestra la morfología de las AuNPs-ACE2 inmovilizadas en el punto de prueba formando fases globulares en la membrana NC que constan de estructuras de 0,55 μm. Después del contacto con la muestra de saliva que contenía el antígeno S1, se formó un complejo sándwich en la línea de prueba que mostró una mayor densidad de estos glóbulos más pequeños con una estructura de 1,3 μm como se muestra en la Fig. 5E, confirmando la inmovilización de la sonda detectora en la superficie de la almohadilla conjugada. Las imágenes SEM de vista superior se muestran en las figuras 5a a e. La membrana NC tenía una estructura porosa uniforme con poros de 8 μm aproximadamente (Fig. 5a), esto aseguró que el complejo de sonda detectora de antígeno fluya suavemente y tuviera el tiempo adecuado para interactuar con la sonda de captura. La morfología de la almohadilla conjugada antes y después de la carga de AuNPs-Nbs se representa en las figuras 5b yc, lo que confirma la carga exitosa de la sonda detectora. La morfología de la línea de prueba antes y después de la formación del complejo con el antígeno S1 se representa en las figuras 5d ye respectivamente.

Análisis morfológico por AFM (A – D) y SEM (a – d) de las superficies de las membranas utilizadas para la construcción de LFT. Membrana NC (A y a), almohadilla de conjugado antes (B y b) y después de cargar el conjugado detector (C y c), línea de prueba con conjugado de captura (D y d), línea de prueba con complejo sándwich (E y e) . Conjugado detector: AuNPs-Nbs en la almohadilla de conjugado. Conjugado de captura: AuNPs-ACE2 en la línea de prueba. Complejo sándwich: antígeno S1 en muestras positivas, intercalado entre el detector y los conjugados de captura en la línea de prueba.

El límite de detección (LoD) para partículas de virus fue de 0,4 × 104 copias/ml para las tiras de AuNPs-Nbs y de 1,6 × 104 copias/ml para las tiras de AuNPs-Mabs (Fig. 6). Además, se presentan las relaciones entre la intensidad y el número de copias virales (Fig. 7). Se observaron fuertes correlaciones positivas entre el número de copias virales y las lecturas de intensidad. En comparación con otros estudios, nuestros resultados revelan una mejora notable en la sensibilidad de las tiras AuNPs-Nbs. Zhang et al.30 desarrollaron una tira reactiva de flujo lateral para la detección de proteínas COVID-19 (RBD & N) utilizando luminógenos AIE (AIEgens) como reporteros. Alcanzaron una concentración de detección de antígeno de 6,9 ng/ml para la proteína RBD y de 7,2 ng/ml para la proteína N30. Además, Lee et al.31 emplearon ACE2 y anti-S1mAb conjugados con nanoperlas de celulosa roja, como sondas de captura y detección respectivamente, en tiras LFT. Informaron que el LoD de su prueba era 1,86 × 105 copias/ml31. Al aplicar las tiras LFT desarrolladas para probar la reacción cruzada con otros antígenos distintos del SARS-CoV-2, no se detectó ninguna reacción cruzada con los antígenos del SARS-CoV o MERS-CoV.

Límite de detección (LoD) para la tira Au-Nbs (A) y Au-mAbs (B), mediante el uso de diluciones en serie de SARS-CoV-2 inactivado a partir de 2,7 × 105 copias/ml.

Las relaciones entre la intensidad del color en la tira LFT mejorada, usando Nbs o mAb, y el número de copias virales en muestras de saliva. r: representa el coeficiente de correlación de Pearson.

Después de probar tres casos positivos con tiras reactivas después de diferentes condiciones de almacenamiento, los análisis de regresión y correlación de las intensidades de color de las líneas de prueba se correlacionaron inversamente con el tiempo y mostraron fuertes correlaciones negativas a temperatura ambiente (r = − 0,97), a 4 ° C (r = − 0,94) y 37 °C (r = − 0,96) (Fig. 8). Para el día 30, la intensidad del color disminuyó significativamente a 4 °C y 37 °C, gradualmente, y mostró los valores más bajos en el día 60 (Fig. 9). Estos resultados revelaron que la mejor estabilidad se obtuvo para las tiras almacenadas a temperatura ambiente, mostrando una gran reproducibilidad durante hasta dos meses en comparación con un mes solo para las tiras basadas en mAb. Para las almacenadas a 37 °C o 4 °C, las tiras mostraron una intensidad de señal débil después de un mes (Fig. S6).

Relación entre intensidad de color y tiempo, a diferentes temperaturas de almacenamiento.

La intensidad a diferentes temperaturas y diferentes intervalos de tiempo. Los datos se muestran como media ± desviación estándar. (a y b) Representan diferencias significativas (p < 0,05), en comparación con los días 0 y 30, respectivamente.

La positividad de los pacientes sintomáticos de COVID-19 se confirmó mediante RT-PCR, la prueba de referencia, y se estimaron sus valores de carga viral (Cts). Las muestras de saliva recolectadas de estos casos sintomáticos se analizaron para detectar la presencia del antígeno S1 utilizando nuestras tiras mejoradas de señal desarrolladas. El análisis de la curva ROC mostró un valor mayor del área bajo la curva (AUC) para la tira LFT basada en Nbs que para las tiras basadas en mAb (Fig. 10). Las medidas de precisión de la tira basada en Nbs y la tira basada en mAb, utilizando RT-PCR como prueba de referencia, se muestran en las Tablas 2 y 3. En sujetos detectados tempranamente con valores de Ct \(\le\) 30, las tiras basadas en Nbs exhibieron mayor sensibilidad (97,14%) que las tiras basadas en mAbs (83,33%). Para la mayoría de los valores de Ct de las tiras basadas en Nbs, la estadística kappa siempre fue superior a 0,8, lo que refleja un nivel de concordancia perfecto con los resultados de RT-PCR. Esta mejora en la sensibilidad podría atribuirse a las características ventajosas de los nanocuerpos, incluida su alta estabilidad, tamaño pequeño y marcada afinidad con su antígeno específico11. Además, la alta sensibilidad de la tira reactiva desarrollada podría atribuirse a la aplicación del sistema de señal mejorada. Esto concuerda con el trabajo de Tanaka et al.24, quienes afirmaron que una tira de señal mejorada, que contiene un detector dual conjugado con oro y sondas de captura, garantiza un ensayo inmunocromatográfico altamente sensible. La intensidad del color de la línea de prueba en la tira LFT es proporcional a la concentración de antígeno de las muestras positivas. El color de la intensidad a diferentes valores de Ct, usando Nbs o mAb, se muestra en la Fig. 11. En la mayoría de los valores de Ct, la tira basada en Nbs mostró una intensidad de color significativamente mayor que una tira basada en mAb.

Curva de característica operativa del receptor (ROC) del ensayo de tira mejorado que utiliza Nbs o mAb en muestras de saliva con RT-PCR como prueba de referencia. AUC: área bajo la curva.

Intensidad de color (volumen × 105) de la línea de prueba de tiras LFT mejorada para la detección del antígeno S1 en muestras de saliva con diferentes valores de Ct utilizando nanocuerpos (Nbs) o anticuerpos monoclonales (mAb). Las barras representan la media ± error estándar. *Representa una diferencia significativa (p < 0,05), en comparación con la tira mejorada con Nbs.

Durante la pandemia de COVID-19, el diagnóstico temprano fue extremadamente crítico para contener la transmisión de enfermedades. La RT-PCR es la herramienta de referencia para el diagnóstico del SARS-CoV-2 pero con diversas limitaciones. Desarrollamos tiras reactivas sensibles y rápidas con señal mejorada, utilizando conjugados de oro duales, para exagerar la intensidad de la señal. Este inmunosensor de doble respuesta diseñado comprende una sonda de captura conjugada con oro (ACE2), así como una sonda detectora conjugada con oro (que utiliza Nbs o mAb). Se descubrió que el uso del conjugado oro-Nbs para la detección del antígeno S1 presenta mejores características de sensibilidad y especificidad que el conjugado oro-mAb. Hasta donde sabemos, somos los primeros en desarrollar tiras reactivas basadas en nanocuerpos para la detección rápida de antígenos del SARS-CoV-2. Además, el uso de muestras de saliva indoloras y fáciles de recolectar como muestra confiable para la detección del antígeno S1 del SARS-CoV-2 permitirá identificar casos de manera rápida y precisa en nuestras comunidades. El desarrollo local de herramientas de diagnóstico tan eficientes, sensibles y ampliamente accesibles para el diagnóstico rápido del antígeno del SARS-CoV-2 en la población egipcia es esencial y obligatorio para el control constante de esta pandemia. Nuestra perspectiva es una mayor modificación de este LFTS con señal mejorada, para mejorar nuestros resultados al obtener una mayor sensibilidad y especificidad para diversas variantes preocupantes del virus, para enfrentar el desarrollo constante de variantes del SARS-CoV-2.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este manuscrito y su archivo de información complementaria.

Zhu, N. y col. Un nuevo coronavirus de pacientes con neumonía en China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jin, YH y cols. Una guía de asesoramiento rápido para el diagnóstico y tratamiento de la neumonía infectada por el nuevo coronavirus (COVID-19) de 2019 (versión estándar). Mil. Medicina. Res. 7, 4 (2020).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Huang, C. y col. Características clínicas de pacientes infectados con el nuevo coronavirus de 2019 en Wuhan, China. Lanceta 395, 497–506 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Verma, MK y cols. Métodos de diagnóstico rápido para la detección del SARS-CoV-2 (COVID-19): un informe basado en evidencia. J. Med. Vida. 14(4), 431–442. https://doi.org/10.25122/jml-2021-0168 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Da Silva, SJR et al. Diagnóstico clínico y de laboratorio del SARS-CoV-2, virus causante del COVID-19. Infección por SCA. Dis. 6, 2319–2336 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Sheikhzadeh, E., Eissa, S., Ismail, A. & Zourob, M. Técnicas de diagnóstico para COVID-19 y nuevos desarrollos. Talento 220, 121392 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Peeling, RW, Olliaro, PL, Boeras, DI & Fongwen, N. Ampliación de las pruebas rápidas de antígenos COVID-19: promesas y desafíos. Infección por lanceta. Dis. 21, e290-e295 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pavelka, M. y col. El impacto de las pruebas rápidas de antígenos en toda la población sobre la prevalencia del SARS-CoV-2 en Eslovaquia. Ciencia 372, 635–641 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holliger, P. & Hudson, PJ Fragmentos de anticuerpos diseñados y el surgimiento de dominios individuales. Nat. Biotecnología. 23, 1126-1136. https://doi.org/10.1038/nbt1142 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hamers-Casterman, C. et al. Anticuerpos naturales desprovistos de cadenas ligeras. Naturaleza 363, 446–448. https://doi.org/10.1038/363446a0 (1993).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Desmyter, A., Decanniere, K., Muyldermans, S. & Wyns, L. Especificidad del antígeno y unión de alta afinidad proporcionada por un solo bucle de un anticuerpo de dominio único de camello. J. Biol. Química. 276, 26285–26290. https://doi.org/10.1074/jbc.M102107200 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Salvador, JP, Vilaplana, L. & Marco, MP Nanobody: Características destacadas para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Anal. Bioanal. Química. 411, 1703–1713. https://doi.org/10.1007/s00216-019-01633-4 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Billingsley, MM, Riley, RS y Day, ES Conjugados de anticuerpo-nanopartículas para mejorar la sensibilidad de los métodos de detección basados en ELISA. MÁS UNO 12(5), e0177592. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0177592 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duan, Y. et al. Sondas de nanopartículas de oro modificadas con anticuerpos enzimáticos para la detección ultrasensible de la proteína de la nucleocápside en SFTSV. En t. J. Medio Ambiente. Res. Salud Pública 17, 4427. https://doi.org/10.3390/ijerph17124427 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Syedmoradi, L. et al. Pruebas en el punto de atención: el impacto de la nanotecnología. Biosens. Bioelectrón. 87, 373–387 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kamel, M. y col. Detección no invasiva del antígeno del SARS-CoV-2 en saliva versus hisopos nasofaríngeos utilizando nanocuerpos conjugados con nanopartículas de oro. tropo. Medicina. Infectar. Dis. 7(6), 102. https://doi.org/10.3390/tropicalmed7060102 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Malik, YA Propiedades del coronavirus y SARS-CoV-2. Malayos. J. Pathol. 42(1), 3-11 (2020).

CAS PubMed Google Académico

Wang, H. y col. La secuencia genética, origen y diagnóstico del SARS-CoV-2. EUR. J.Clin. Microbiol. Infectar. Dis. 39(9), 1629-1635. https://doi.org/10.1007/s10096-020-03899-4 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cerón, JJ et al. Uso de saliva para diagnóstico y seguimiento del SARS-CoV-2: una perspectiva general. J.Clin. Medicina. 9, 1491. https://doi.org/10.3390/jcm9051491 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kafle, D. & Sapkota, D. ¿La saliva como muestra biológica para el diagnóstico de COVID-19? Universidad de Katmandú. Medicina. J. (KUMJ) 18(70), 107–110 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Uddin, M. y col. Rendimiento diagnóstico de la saliva recolectada por uno mismo frente al hisopo nasofaríngeo para la detección molecular del SARS-CoV-2 en el entorno clínico. Microbiol. Espectro 9(3), e0046821. https://doi.org/10.1128/Spectrum.00468-21 (2021).

Artículo de Google Scholar

Frens, G. Nucleación controlada para la regulación del tamaño de partículas en suspensiones de oro monodispersas. Nat. Física. Ciencia. 241, 20-22. https://doi.org/10.1038/physci241020a0 (1973).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Borse, V. & Konwar, AN Síntesis y caracterización de nanopartículas de oro como herramienta de detección para el desarrollo de inmunoensayos de flujo lateral. Sensores Int. 1(2020), 100051. https://doi.org/10.1016/j.sintl.2020.100051 (2020).

Artículo de Google Scholar

Tanaka, R. y col. Un nuevo ensayo de mejora para tiras reactivas inmunocromatográficas que utiliza nanopartículas de oro. Anal. Bioanal. Química. 385(8), 1414-1420. https://doi.org/10.1007/s00216-006-0549-4 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Goossens, J. y col. Funcionalización de nanopartículas de oro con nanocuerpos mediante adsorción física. Anal. Métodos 9, 3430–3440 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Sharma, PK y cols. Chip sensor capacitivo doble interdigitado (DIDC) modificado con óxido de grafeno ultrasensible y reutilizable para detectar el SARS-CoV-2. Sens. ACS 6(9), 3468–3476. https://doi.org/10.1021/acssensors.1c01437 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Landis, JR & Koch, GG La medición del acuerdo de observador para datos categóricos. Bioma. 33, 159. https://doi.org/10.2307/2529310 (1977).

Oliver, C. Conjugación de oro coloidal con proteínas. Métodos Mol. Biol. 588, 369–373 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kaur, M. & Eltzov, E. Optimización de parámetros efectivos para mejorar la sensibilidad del ensayo de flujo vertical para la detección de Escherichia coli. Biosensores 12(2), 63. https://doi.org/10.3390/bios12020063 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, GQ y cols. Una tira reactiva de flujo lateral portátil basada en AIEgen para la detección rápida de la proteína RBD y la proteína N del SARS-CoV-2. Representante celular Phys. Ciencia. 3(2), 100740. https://doi.org/10.1016/j.xcrp.2022.100740 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, JH y cols. Una nueva detección rápida de los antígenos pico 1 del SARS-CoV-2 utilizando la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) humana. Biosens. Bioelectrón. 171, 112715. https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112715 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Descargar referencias

Este artículo se basa en un trabajo apoyado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) bajo la subvención 77741. Los autores desean agradecer al Dr. Ahmed El Taweel, investigador de virología, Centro de Excelencia Científica para el Virus de la Influenza, División de Investigación Ambiental, Centro Nacional de Investigación de Egipto, por proporcionar los aislados inactivados de SARS-CoV-2.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco Egipcio de Conocimiento (EKB). Este trabajo fue apoyado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF), Egipto, bajo la subvención (44471).

Departamento de Inmunología, Instituto de Investigación Theodor Bilharz, Giza, Egipto

Sara Maher, Manal Kamel, Zeinab Demerdash, Hanan El Baz, Amany Saad, Noha Ali, Faten Salah y Shimaa Atta

Control de infecciones y microbiología clínica, Instituto de Investigación Theodor Bilharz, Giza, Egipto

Omar Sayyouh

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Conceptualización, metodología de SM y MK y SM, HB y ZD escribieron y revisaron el manuscrito principal; Metodología y redacción de SA, FS y NA: borrador original; SA, OS y AS, curación de datos, metodología. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Sara Maher.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Maher, S., Kamel, M., Demerdash, Z. et al. Nanocuerpos conjugados con oro en una tira reactiva de flujo lateral con señal mejorada para la detección rápida del antígeno S1 del SARS-CoV-2 en muestras de saliva. Representante científico 13, 10643 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37347-y

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Recibido: 20 de febrero de 2023

Aceptado: 20 de junio de 2023

Publicado: 30 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37347-y

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