Nanocalentamiento y hielo

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 220 (2023) Citar este artículo

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La preservación exitosa de órganos o tejidos a largo plazo revolucionaría la biomedicina. La criopreservación del cartílago permite una vida útil prolongada del cartílago articular, lo que plantea la posibilidad de ampliar la implementación de un prometedor trasplante de aloinjerto osteocondral (OCA) para la reparación del cartílago. Sin embargo, el cartílago criopreservado de gran tamaño no se puede calentar con éxito con el método de calentamiento por convección convencional debido a su velocidad de calentamiento limitada, lo que bloquea su potencial clínico. Aquí, desarrollamos un método de criopreservación sin hielo y nanocalentamiento para la preservación intacta del cartílago articular de gran tamaño. Nuestro método logra una velocidad de calentamiento de 76,8 °C min-1, más de un orden de magnitud mayor que el calentamiento por convección (4,8 °C min-1). Utilizando pruebas sistemáticas a nivel de células y tejidos, demostramos el rendimiento superior de nuestro método para preservar el cartílago grande. También se observa y recapitula una manera de preservación dependiente de la profundidad mediante imágenes por resonancia magnética y modelado computacional. Finalmente, mostramos que la entrega de nanopartículas al lado del hueso OCA podría ser una dirección factible para una mayor optimización de nuestro método. Este estudio es pionero en la aplicación de nanocalentamiento y criopreservación sin hielo para cartílago articular grande y proporciona información valiosa para el desarrollo futuro de técnicas, allanando el camino para aplicaciones clínicas de cartílago criopreservado.

El trasplante de órganos o tejido en masa ha salvado millones de vidas y ha mejorado la calidad de vida de los pacientes que padecen insuficiencia orgánica o enfermedades tisulares1,2. Sin embargo, el número de órganos y tejidos listos para el trasplante está lejos de cubrir las necesidades de la población de pacientes. Por ejemplo, en 2020, se realizaron 39.036 trasplantes de órganos en Estados Unidos y se agregaron 55.121 nuevos candidatos a la lista de espera3; Muchos pacientes mueren mientras esperan el trasplante de órganos. A pesar de la enorme demanda insatisfecha de órganos y tejidos, el hecho decepcionante es que muchos órganos y tejidos no son viables para su implantación y se descartan porque alcanzan el límite máximo de tiempo de conservación post mortem1,4. En el caso del trasplante de órganos, hasta el 70% de los órganos de los donantes caducan antes de llegar a los pacientes1,4. Lograr la preservación de órganos y tejidos a largo plazo es fundamental para mejorar las tasas de utilización y aliviar la escasez existente.

Los defectos del cartílago articular son problemas comunes de la rodilla y afectan al 60-66% de los pacientes sometidos a procedimientos artroscópicos5,6,7,8. Debido a la capacidad regenerativa limitada del cartílago articular, los defectos del cartílago pueden convertirse en osteoartritis (OA) sin una intervención quirúrgica adecuada. La OA afecta a más de 25,6 millones de adultos y genera casi 200 mil millones de dólares en costos relacionados cada año en los Estados Unidos9. A medida que la población crece y envejece, se prevé que el número de pacientes con OA aumente drásticamente10. Actualmente, no existe cura para la OA, lo que demuestra la necesidad de continuar la investigación en esta área. El trasplante de aloinjerto osteocondral (OCA) es una estrategia atractiva de reparación del cartílago para controlar la progresión de la OA, particularmente en pacientes jóvenes y físicamente activos con defectos grandes11. En comparación con otras opciones de tratamiento, como la microfractura, la implantación de condrocitos autólogos, el trasplante de autoinjerto osteocondral y los enfoques emergentes de ingeniería de tejidos, el trasplante de OCA reemplaza inmediatamente el sitio del defecto con cartílago hialino funcional de espesor total, requiere solo un único procedimiento quirúrgico y evita el problema de Mortalidad en el sitio donante12,13. El trasplante de OCA también es una opción quirúrgica preferida para pacientes con daño generalizado del cartílago, lesión del hueso subcondral o cirugía previa fallida del cartílago12,13. La tasa media de supervivencia a 10 años del trasplante de OCA es del 78,7%14, y entre el 75 y el 88% de los pacientes pueden volver a practicar deportes después del trasplante15. El uso clínico del trasplante de OCA para la restauración del cartílago ha ganado popularidad durante la última década16 y se espera una mayor necesidad de OCA en el futuro. Sin embargo, la disponibilidad de OCA nuevas es limitada. Los métodos actuales de almacenamiento hipotérmico estándar para el almacenamiento de OCA solo pueden preservar las propiedades funcionales de la OCA hasta 28 días antes de la implantación17,18. Este plazo suele ser insuficiente teniendo en cuenta el tiempo prolongado necesario para la planificación quirúrgica, incluida la recolección de OCA, el transporte, una detección de enfermedades infecciosas de un mínimo de 14 días, la compatibilidad de los injertos, la preparación del paciente y otra logística relacionada. Casi el 30% de los OCA se descartan sin implantación en los Estados Unidos19, lo que supone un desafío adicional para la disponibilidad de OCA y restringe la implementación amplia del trasplante de OCA.

Se han utilizado métodos de conservación a largo plazo para mejorar la vida útil de los OCA. Los primeros intentos propusieron el uso de un método de congelación simple para la conservación de OCA, pero estudios posteriores revelaron que el cartílago conservado mediante este método tiene una baja viabilidad celular y una pobre integridad extracelular, lo que compromete los resultados en estudios de trasplante tanto en animales como en humanos20,21. Luego se introdujo la vitrificación, un proceso que transfiere una solución líquida a un sólido vítreo sin formación de hielo. En este enfoque, los OCA se sumergen en soluciones de agente crioprotector (CPA) de alta concentración y luego se enfrían a temperaturas bajo cero. La incorporación de CPA reduce significativamente los requisitos de velocidad de enfriamiento, lo que hace factible lograr un almacenamiento sin hielo con equipos de laboratorio de rutina. La vitrificación se ha utilizado con éxito para criopreservar OCA en pequeños volúmenes en múltiples especies, incluidos conejos22,23, cerdos24,25 y humanos26,27. En estos estudios, el tamaño de las muestras de cartílago articular se limitó a 10 mm de diámetro y el volumen de la solución de CPA circundante se mantuvo por debajo de 3 ml. Dado que entre el 36% y el 54% de los defectos del cartílago miden más de 1 cm2 5,7, la criopreservación de OCA grandes es necesaria, pero sigue siendo un desafío, particularmente con respecto al proceso de calentamiento28,29. Actualmente, las muestras vitrificadas comúnmente se calientan mediante una estrategia de convección utilizando un baño de agua tibia (37 °C). El calor se transfiere gradualmente desde el baño de agua, a través del CPA circundante y finalmente al tejido. Sin embargo, debido al límite de transferencia de calor, el calentamiento por convección podría no alcanzar las tasas de calentamiento críticas de CPA (normalmente carpetas u órdenes de magnitud superiores a las tasas de enfriamiento críticas) en muestras más grandes, lo que provocaría una formación de hielo perjudicial. Además, el calentamiento no uniforme durante el calentamiento por convección podría causar un estrés térmico que exceda el cumplimiento mecánico de la muestra, lo que provocaría grietas y daños en las muestras conservadas30,31,32.

Se han propuesto varios métodos de calentamiento volumétrico para resolver los problemas de uniformidad y velocidad de calentamiento, incluido el calentamiento por láser y el calentamiento por microondas. El método de calentamiento por láser calienta rápidamente la muestra en presencia de moléculas que absorben el láser, como las nanobarras de oro33,34. A pesar de su eficacia de calentamiento ultrarrápido, su aplicación se limita actualmente al calentamiento de muestras de microlitros, como células y embriones, debido a la restricción de la profundidad de penetración del láser33,34. El calentamiento por microondas puede calentar directamente la muestra excitando los dipolos eléctricos de su molécula con campos electromagnéticos de alta frecuencia (cientos de MHz a GHz)35,36. Aunque este método puede lograr una alta tasa de calentamiento, es propenso a problemas de fuga térmica, un fenómeno de mayores diferencias de temperatura entre el sitio calentado y el sitio frío debido a la propiedad dieléctrica dependiente de la temperatura de la muestra calentada, lo que causa puntos calientes desfavorables28,35 ,36. La eficiencia de calentamiento o el perfil del calentamiento por microondas también depende de la forma de la muestra35,37, lo que complica aún más sus aplicaciones generales.

Recientemente, se ha desarrollado una técnica de nanocalentamiento para la criopreservación de muestras grandes28,30,31,32,38,39,40,41. Las muestras vitrificadas cargadas con nanopartículas magnéticas de óxido de hierro (mIONP) se exponen a un campo magnético alternativo de baja radiofrecuencia (cientos de kHz) para calentarse, a diferencia del calentamiento por convección tradicional que se basa en la transferencia pasiva de calor desde el baño de agua a las muestras. A diferencia del método de calentamiento por microondas de alta frecuencia37,42, el campo magnético de baja radiofrecuencia por sí solo no puede calentar rápidamente los tejidos; sin embargo, puede inducir calor de manera eficiente a través de los mIONP, donde la magnitud y la frecuencia del campo magnético y la concentración de los mIONP se pueden ajustar para lograr la velocidad de calentamiento deseada30. Como el campo magnético de baja radiofrecuencia puede penetrar el tejido sin atenuación, se puede lograr un calentamiento uniforme una vez que el campo magnético es homogéneo y los mIONP se distribuyen uniformemente dentro del tejido. Se ha aplicado nanocalentamiento combinado con vitrificación para preservar arterias30, válvulas cardíacas porcinas30, riñones de rata32 y corazones de rata31,38 con distintos grados de éxito. El nanocalentamiento para la preservación de órganos o tejidos aún está en su infancia y el enfoque anterior se ha limitado a sistemas biológicos delgados o altamente vascularizados. Los tejidos delgados, como las valvas de las válvulas cardíacas y las arterias, permiten una rápida transferencia de calor con nanopartículas en estrecha proximidad, mientras que los sistemas vascularizados (p. ej., corazones y riñones de rata) facilitan la distribución de nanopartículas por todo el órgano. Además, cabe destacar que el volumen real de órganos calentados mediante nanocalentamiento es pequeño; el volumen del corazón y del riñón de la rata, por ejemplo, está por debajo de 1 ml31,32,38. No se ha intentado aplicar la técnica de nanocalentamiento para la preservación de tejidos cartilaginosos grandes, densos y avasculares.

Aquí, desarrollamos un método de criopreservación sin hielo y nanocalentamiento mediante la integración de técnicas de vitrificación del cartílago y nanocalentamiento para la preservación de OCA grandes. Con este método, la velocidad de calentamiento durante el proceso de calentamiento mejoró en un orden de magnitud, superando la dificultad del recalentamiento lento con convección en un baño tibio. También se realizó una caracterización sistemática de los comportamientos a nivel de células y tejidos del cartílago para proporcionar una evaluación de amplio espectro de nuestro método para la preservación de grandes OCA. Nuestros resultados mostraron que el nanocalentamiento y la criopreservación sin hielo superaron al método de convección tradicional en combinación con la criopreservación sin hielo al rescatar más células vivas y mantener un mayor nivel de actividad metabólica celular. En comparación con el calentamiento por convección, nuestro método también mostró una tendencia a un mejor rendimiento en el mantenimiento del material del cartílago y las propiedades mecánicas. Junto con el modelado computacional y la resonancia magnética (MRI), se recapituló la observación experimental de la manera de preservación dependiente de la profundidad y se sugirió la entrega de mIONP al hueso subcondral como un posible medio para optimizar aún más el rendimiento de nuestro método para OCA grandes. preservación. Este estudio es pionero en la aplicación de vitrificación sin hielo y nanocalentamiento para la preservación del cartílago articular grande y proporciona información valiosa para el desarrollo futuro de la técnica y la traducción de esta técnica a la práctica clínica del trasplante de OCA.

Se recolectaron muestras grandes de OCA (largo x ancho x espesor, ~30 mm x 20 mm x 14 mm) (Fig. 1a) y se cargaron con soluciones de CPA a 4 °C mediante un protocolo paso a paso para garantizar la vitrificación durante el proceso de enfriamiento (Fig. 1b). La vitrificación OCA exitosa se logró sin que se observaran grietas ni formación de hielo en la muestra (Figura complementaria 1a). La velocidad de enfriamiento también cumplió con los requisitos de vitrificación (Figuras complementarias 1b, c). En el grupo de nanocalentamiento, se agregaron mIONP justo después del paso final de carga de CPA. En este estudio se probaron múltiples soluciones de CPA, incluidas VS55, VS70 y VS83. Después de la vitrificación y el almacenamiento, la OCA vitrificada se calentó mediante uno de dos mecanismos: calentamiento por convección o nanocalentamiento. El calentamiento por convección se logró colocando la muestra en un baño de agua a 37 °C mientras que el nanocalentamiento se implementó en una bobina personalizada con un campo magnético alterno de radiofrecuencia (Fig. 1b). La medición de temperatura en soluciones de CPA puro con 2 mg ml-1 mIONP mostró que la velocidad de calentamiento fue de 76,80 ± 2,27 °C min-1 para el método de nanocalentamiento, que fue más de un orden de magnitud mayor que los 4,80 ± 1,51 °C min-1 logrados. por calentamiento por convección (Fig. 1c y Fig. complementaria 2). Durante el proceso de recalentamiento, no se observaron grietas en el grupo de nanocalentamiento, mientras que se observaron claramente grietas en el CPA circundante en el grupo de convección. Estos resultados, de acuerdo con la literatura anterior28,30,31,32,38,39,40,41, demuestran la capacidad de recalentar rápidamente la muestra mediante nanocalentamiento. Por lo tanto, nuestro método permite la preservación a largo plazo de grandes OCA.

a OCA de tróclea femoral porcina utilizada en este estudio. El tamaño de OCA es ~30 mm × 20 mm × 14 mm (largo × ancho × espesor). b Flujo esquemático de dos métodos de criopreservación. Para ambas estrategias, la OCA porcina se cargó primero con una solución de CPA a 4 °C siguiendo un protocolo de carga de CPA paso a paso. La OCA se sumergió en solución de CPA con concentración creciente (0%, 18,5%, 25%, 50%, 75% y 100%) secuencialmente durante 20 min en cada paso. Luego la OCA fue vitrificada y almacenada en un congelador mecánico. Los mIONP se agregaron inmediatamente después del paso final de carga de CPA al 100% a una concentración de 2 mg ml-1 para el grupo de nanocalentamiento. Durante el recalentamiento, el nanocalentamiento de las OCA vitrificadas se realizó en una bobina personalizada que generaba un campo magnético alternativo de radiofrecuencia, mientras que el calentamiento por convección se realizó con las OCA vitrificadas en un baño de agua tibia (37 °C). Después del recalentamiento, todos los OCA pasaron por un paso de descarga de manera inversa al protocolo de carga para eliminar el CPA. c Velocidad de calentamiento lograda mediante calentamiento por convección y nanocalentamiento (Figura complementaria 2d, e). n = 3 muestras independientes para el grupo de convección y n = 4 muestras independientes para el grupo de nanocalentamiento. El valor p se determinó con una prueba t bilateral. Todos los datos representan la media ± desviación estándar.

Se aplicó un ensayo alamarBlue para evaluar la actividad metabólica de las células del cartílago después del recalentamiento. En consonancia con nuestro estudio anterior25, el cartílago conservado con VS83 mostró un nivel de actividad metabólica mucho más alto que el cartílago conservado con VS70 tanto en el grupo de convección como en el de nanocalentamiento (Fig. 2a). Los resultados con el VS55 más utilizado mostraron el nivel más bajo de actividad metabólica celular (Figura complementaria 3). Por lo tanto, se utilizó VS83 para todos los estudios posteriores. Además, el cartílago en el grupo de nanocalentamiento tuvo una actividad metabólica celular significativamente mayor que el cartílago calentado con convección (Fig. 2a). En particular, el cartílago nanocalentado con VS83 mostró una recuperación total de la actividad metabólica celular después de un cultivo de 2 días en medio (Fig. 2a). Estos resultados, junto con las mediciones de la velocidad de enfriamiento y calentamiento (Figuras complementarias 1, 2), indican una mejor preservación de la función celular con nanocalentamiento en comparación con el calentamiento por convección. La viabilidad de las células del cartílago se examinó empleando tinción fluorescente viva/muerta inmediatamente después del recalentamiento. Las células de cartílago frescas estaban vivas en toda la muestra y mostraban fuertes señales de fluorescencia verde (Fig. 2b). En el grupo de convección, solo una pequeña porción de las células en la zona superficial del cartílago estaba viva, mientras que el cartílago en el grupo de nanocalentamiento tenía más células vivas tanto en la zona superficial como en la profunda (Fig. 2b). El análisis cuantitativo de la viabilidad celular en la zona superficial mostró que el cartílago nanocalentado tenía una viabilidad celular significativamente mayor que el cartílago calentado por convección (Fig. 2c). La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) también reveló que el cartílago en el grupo de convección tenía más espacios en blanco que el cartílago en los grupos fresco y nanocalentado (Fig. 2d). Se cree que estos espacios blancos vacíos son un signo de formación de hielo durante la conservación22, lo que sugiere una falla en el recalentamiento del cartílago por convección. También se realizó la tinción con safranina O y mostró más espacios en blanco en el cartílago calentado por convección que en el cartílago fresco y nanocalentado (Figura complementaria 4). Sin embargo, se encontraron apariencias de color similares entre los tres grupos (Figura complementaria 4), lo que indica alteraciones mínimas o nulas en el contenido de glucosaminoglucanos después del calentamiento por convección y el nanocalentamiento.

a Los resultados de la actividad metabólica celular se midieron mediante el ensayo alamarBlue. Los resultados se normalizaron al valor de cartílago de control fresco medido el día 0 de cada experimento por lotes. La línea discontinua gris indica una recuperación del 100%, alcanzando el nivel de actividad metabólica celular del cartílago fresco (n = 3 muestras independientes para los grupos de convección y nanocalentamiento con soluciones VS70. n = 4 muestras independientes para los grupos de convección y nanocalentamiento con soluciones VS83) . b Resultados representativos de tinción de fluorescencia viva/muerta medidos con muestras recolectadas inmediatamente después del recalentamiento. Zona superficial SZ, zona profunda DZ. La línea discontinua blanca indica la región superficial para el análisis de cuantificación de la viabilidad celular que se muestra en (c). Las barras de escala representan 200 μm. c Viabilidad celular cuantificada en la capa superficial de imágenes de tinción fluorescente viva/muerta en cartílagos frescos (n = 8 muestras independientes), convección (n = 7 muestras independientes) y nanocalentamiento (n = 12 muestras independientes). El valor p se determinó con ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Bonferroni. d Se recogieron imágenes representativas de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de cartílagos frescos, de convección y de nanocalentamiento inmediatamente después del recalentamiento. Zona superficial SZ, imagen ampliada que se muestra en el cuadro punteado rojo; Zona profunda DZ, imagen ampliada que se muestra en el cuadro discontinuo negro. Las barras de escala representan 200 μm. Las flechas negras resaltan ubicaciones con espacios en blanco, lo que indica una posible formación de hielo. Todos los datos representan la media ± desviación estándar. Nota: Los mIONP del grupo nanowaming se cargan mediante el enfoque de inmersión para todos los datos presentados aquí.

El cartílago articular está compuesto principalmente de agua, colágeno y proteoglicanos, y exhibe propiedades electromecánicas. Por tanto, las alteraciones de las propiedades del material tisular pueden afectar negativamente a la función del cartílago. Actualmente, la viabilidad de los condrocitos es el principal parámetro para evaluar el resultado de diferentes estrategias de criopreservación del cartílago articular; Las propiedades de la matriz tisular se pasan por alto en gran medida. En este estudio, se utilizaron mediciones de conductividad eléctrica con cartílago equilibrado en soluciones isotónicas e hipotónicas de KCl para evaluar los cambios en la conductividad del cartílago y la densidad de carga fija (FCD) después de procesos de calentamiento por convección y nanocalentamiento (Fig. 3a)43,44. FCD es una medida de las cargas negativas adheridas a los proteoglicanos43,44. Los resultados mostraron que las conductividades del cartílago fueron similares entre los grupos de fresco, convección y nanocalentamiento tanto para las condiciones isotónicas como para las hipotónicas (Fig. 3b). Aunque no se encontraron diferencias significativas en el contenido de FCD entre los tres grupos, el grupo de convección tuvo un valor de FCD más bajo que los grupos fresco y de nanocalentamiento (Fig. 3c). La porosidad del tejido también fue similar entre los tres grupos (Fig. 3d). Estos resultados indican que ni la convección ni el nanocalentamiento tuvieron impactos importantes en las propiedades eléctricas y de composición del cartílago, pero el cartílago nanocalentado era más similar al cartílago fresco que el cartílago calentado por convección.

a Esquema de medición de la conductividad eléctrica. La conductividad eléctrica del cartílago y la FCD se determinaron con un aparato de conductividad personalizado que consta de un micrómetro de detección de corriente para medir el espesor del cartílago, dos electrodos de corriente, dos electrodos de voltaje Ag/AgCl y una cámara cilíndrica. b Conductividad eléctrica de cartílago fresco (n = 11 muestras independientes), convección (n = 10 muestras independientes) y nanocalentamiento (n = 13 muestras independientes) medidas en condiciones isotónicas e hipotónicas. c FCD de cartílago fresco (n = 11 muestras independientes), convección (n = 10 muestras independientes) y nanocalentamiento (n = 13 muestras independientes). d Porosidad del cartílago fresco (n = 11 muestras independientes), convección (n = 10 muestras independientes) y nanocalentamiento (n = 13 muestras independientes). Todos los datos representan la media ± desviación estándar. Nota: Los mIONP del grupo nanowaming se cargan mediante el enfoque de inmersión para todos los datos presentados aquí.

Se evaluaron las propiedades biomecánicas del cartílago para evaluar el impacto de ambas estrategias de calentamiento en la función mecánica del tejido. Se realizaron pruebas de microindentación en tapones osteocondrales intactos perforados a partir de OCA grandes para los tres grupos (Fig. 4a). Los resultados de la sangría no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (Fig. 4b, c). Sin embargo, el módulo de contacto de equilibrio del cartílago, un parámetro que caracteriza la resistencia mecánica de la matriz del cartílago, fue menor en el grupo de convección que en los grupos fresco y de nanocalentamiento (Fig. 4b). La permeabilidad también fue mayor en el grupo de convección que en los otros dos grupos (Fig. 4c). Estos resultados indicaron además un mejor rendimiento a nivel de tejido con el método de nanocalentamiento en comparación con el método de convección. Dado que la prueba de microindentación explora principalmente la respuesta mecánica del cartílago en la capa superficial (~ 200 μm), se realizó un experimento de compresión confinada para investigar las propiedades mecánicas del cartílago de espesor total (Fig. 4d). Se recortó el lado óseo de los tapones osteocondrales y se colocaron muestras de cartílago articular cilíndrico en la cámara confinada para las pruebas de relajación. Los experimentos de compresión confinada mostraron que el cartílago de los grupos de convección y nanocalentamiento mostraba módulos agregados significativamente más bajos que el grupo de cartílago fresco, mientras que no se encontraron diferencias significativas en la permeabilidad (Fig. 4e, f). Estos resultados indican que la capa superficial del cartílago se conservó mejor que las regiones medias o profundas, lo que se hace eco de los resultados de la tinción fluorescente viva/muerta (Fig. 2b, c) y demuestra una dependencia de la profundidad para la preservación del cartílago.

a Esquema de experimentos de microindentación. Las propiedades mecánicas de la superficie del cartílago se midieron utilizando un sistema de microindentación que consta de una etapa piezoeléctrica, una bola niveladora de 2 ejes, una cámara de muestra y una bola de rubí esférica (1 mm de diámetro). Los tapones osteocondrales se probaron sumergidos en soluciones de PBS. b Resultados del módulo de contacto de equilibrio de cartílago fresco (n = 14 mediciones de 5 muestras independientes), convección (n = 14 mediciones de 5 muestras independientes) y nanocalentamiento (n = 15 mediciones de 5 muestras independientes) determinados mediante pruebas de microindentación. c Resultados de permeabilidad de cartílago fresco (n = 14 mediciones de 5 muestras independientes), convección (n = 14 mediciones de 5 muestras independientes) y nanocalentamiento (n = 15 mediciones de 5 muestras independientes) determinados mediante pruebas de microindentación. d Esquema de una prueba de compresión confinada. Analizador mecánico dinámico DMA. Se comprimieron tapones de cartílago entre una sonda de prueba (5 mm de diámetro) y una placa porosa mientras se sentaban en un anillo de confinamiento. e Resultados del módulo agregado de cartílago fresco (n = 9 muestras independientes), convección (n = 7 muestras independientes) y nanocalentamiento (n = 14 muestras independientes) medidos mediante pruebas de compresión confinada. El valor p se determinó con ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Bonferroni. f Resultados de permeabilidad de cartílago fresco (n = 9 muestras independientes), convección (n = 7 muestras independientes) y nanocalentamiento (n = 14 muestras independientes) medidos mediante pruebas de compresión confinada. Todos los datos representan la media ± desviación estándar. Nota: Los mIONP del grupo nanowaming se cargan mediante el enfoque de inmersión para todos los datos presentados aquí.

Los exámenes a nivel de células y tejidos demuestran una mejor preservación del cartílago articular grande con nanocalentamiento en comparación con el calentamiento por convección, particularmente en la capa superficial. Para estudiar más a fondo la capacidad de preservación del nanocalentamiento, se utilizó modelado computacional para simular el proceso de nanocalentamiento del cartílago. Como hay datos térmicos de VS83 muy limitados en la literatura, comparamos los comportamientos térmicos entre las soluciones VS83 y las soluciones VS55. Las mediciones directas de la densidad de la solución revelaron que tanto VS83 como VS55 tienen densidades de solución similares de aproximadamente 1100 kg m-3 (Figura complementaria 5a). En condiciones idénticas, las mediciones de temperatura de enfriamiento, calentamiento por convección y nanocalentamiento mostraron perfiles de temperatura muy similares entre VS55 y VS83 (Figuras complementarias 5b-f), lo que indica que las propiedades térmicas de VS55 y VS83 son similares. Por lo tanto, los parámetros térmicos de las soluciones VS55 se utilizaron en el estudio de modelado posterior. Como aportación importante al modelo, también se determinó la tasa de generación de calor inducida por el nanocalentamiento. Los resultados del modelado con VS83 que contiene mIONP revelaron una relación lineal entre la tasa de calentamiento y la tasa de generación de calor (\(q\)), lo que respalda la característica de calentamiento uniforme del procedimiento de nanocalentamiento (Figura complementaria 5g, h). Tomando la velocidad de calentamiento de 76,80 °C min-1, medida en VS83 con 2 mg ml-1 mIONP, obtuvimos el valor correspondiente de la tasa de generación de calor, 2,956 × 106 W m-3 (Figura complementaria 5h). Para validar aún más el valor de la tasa de generación de calor determinada anteriormente, se midió la velocidad de calentamiento de VS83 con 1 mg ml-1 mIONP durante el nanocalentamiento y se comparó con el valor del modelado. Nuestros resultados mostraron que la velocidad de calentamiento experimental con 1 mg ml-1 mIONP fue de 41,39 ± 1,21 °C min-1, lo que coincidió con el valor de modelado de 38,40 °C min-1 (error relativo del 7,8%) (Figura complementaria 5h). Por lo tanto, se estimó que el valor de la tasa de generación de calefacción para el VS83 con 2 mg m-1 mIONP era 2,956 × 106 W m-3 y se utilizó en los modelos posteriores. Luego, se examinó la distribución de mIONP mediante inspección visual y exploraciones por resonancia magnética (MRI) de OCA. Se descubrió que la apariencia de OCA y su contraste de resonancia magnética no cambiaron con el aumento del tiempo de incubación de OCA en soluciones de mIONP (Fig. 5a, b y Fig. Suplementaria 6), lo que indica que los mIONP no pudieron penetrar tanto el cartílago como la porción ósea del OCA con el protocolo de carga por inmersión vigente. Por lo tanto, en el modelo computacional que consiste en una solución de OCA y CPA en un tubo cilíndrico (Fig. 5c), no se definió ninguna fuente de calor en la región de OCA.

a Inspección visual de OCA incubada en soluciones VS83 con 2 mg ml-1 mIONP durante 0 min (sin incubación), 3 min, durante la noche (~12 h) y 2 días (~48 h). Vista lateral SV, vista lateral ósea BV. b Exploraciones por resonancia magnética de OCA incubadas en soluciones VS83 con 2 mg ml-1 mIONP durante 0 min (sin incubación), 3 min, durante la noche (~12 h) y 2 días (~48 h) utilizando una secuencia de eco de gradiente. Las barras de escala representan 4 mm. c Geometría de la muestra de OCA y el tubo para el modelado computacional de nanocalentamiento. El tubo se llenó con las soluciones de CPA. Dimensiones del tubo: 14 mm de radio y 63 mm de altura (~39 ml); las dimensiones de OCA: 20 mm de ancho, 30 mm de largo y 14 mm de profundidad (~9 ml). d Perfil de temperatura en el plano de sección transversal del sistema modelo después de 83 s de nanocalentamiento. \(q\)cartílago y \(q\)hueso son las tasas de generación de calor en la región del cartílago y la región ósea, respectivamente. Los sitios en la superficie del cartílago (CS), 300 µm debajo de la superficie del cartílago (CS@300 µm) y la interfaz cartílago-hueso (CBI) se indican con puntos grises, rojos y amarillos. e Perfil de temperatura en el plano de sección transversal del sistema de modelado después de 83 s de calentamiento por convección. f Perfil de temperatura en CS, CS@300 µm y CBI para nanocalentamiento y calentamiento por convección. La línea verde y la cinta sombreada de verde claro muestran el valor de temperatura promedio recopilado de las mediciones experimentales en la superficie del cartílago y su desviación estándar, respectivamente (n = 4 muestras independientes). Las líneas gris, roja y amarilla son los datos del modelado. g Velocidad de calentamiento en CS, CS@300 µm y CBI derivada del perfil de temperatura presentado en (e). Los datos experimentales se miden a partir de n = 4 muestras independientes. El valor p se determinó con una prueba t bilateral. Todos los datos representan la media ± desviación estándar. Nota: Los mIONP del grupo nanowaming se cargan mediante el enfoque de inmersión para todos los datos presentados aquí.

Los resultados del modelado demostraron una distribución de temperatura no uniforme dentro de la OCA (Fig. 5d), lo que se esperaba ya que no había mIONP presentes dentro de la OCA. A modo de comparación, también se modeló el proceso de calentamiento por convección. Los resultados mostraron un aumento de temperatura de OCA mucho más lento debido al calentamiento por convección (Fig. 5e). Al caracterizar el perfil de temperatura a diferentes profundidades del cartílago, se observó un perfil de temperatura dependiente de la profundidad en el modelado de nanocalentamiento, y el aumento de temperatura fue mucho más rápido en el nanocalentamiento que en el calentamiento por convección (Fig. 5d-f). La velocidad de calentamiento fue máxima en la superficie del cartílago y disminuyó gradualmente con la profundidad (Fig. 5g). También se recogieron datos experimentales de temperatura en la superficie del cartílago para validar los hallazgos del modelado. Los resultados mostraron que el grupo de nanocalentamiento presentó un aumento de temperatura mucho más rápido y una tasa de calentamiento significativamente mayor que el grupo de calentamiento por convección (Fig. 5f, g). Los resultados del modelado coincidieron con las observaciones experimentales (Fig. 2b, cy Fig. 4), lo que demuestra el beneficio del nanocalentamiento para preservar la capa superficial del cartílago y revela la capacidad limitada del nanocalentamiento para preservar el cartílago de espesor total.

La optimización del protocolo podría mejorar aún más el rendimiento de nuestro método para la preservación de grandes OCA. Debido a la ausencia de mIONP dentro de los OCA, nuestro método calentó la solución de CPA circundante mediante nanocalentamiento y el cartílago se calentó mediante la transferencia de calor desde la solución circundante a la superficie del cartílago y luego a la región profunda del cartílago. Sin embargo, si los mIONP pueden administrarse a la región ósea de los OCA, se generará calor dentro de la región ósea. Luego, el calor se puede transferir al cartílago a través de la vía de calor en el lado del hueso del cartílago, lo que resulta en un recalentamiento más rápido del cartílago. Para probar la viabilidad de esta idea, se realizó una inyección directa de mIONP en el lado del hueso (Fig. 6a). La inspección visual mostró la administración exitosa de mIONP en la región ósea de OCA (Fig. 6b), y los resultados de la resonancia magnética validaron la presencia de mIONP en la región de inyección (Fig. 6c). Luego realizamos un modelado computacional para evaluar el efecto de la administración de mIONP sobre el nanocalentamiento de OCA. Implementamos el mismo modelo computacional utilizado anteriormente (Fig. 5c) e introdujimos un término de fuente de calor en la región ósea. El valor del término de la fuente de calor en la región del hueso se definió como la mitad (Fig. 6d – f) o igual (Fig. 6g – i) al de la solución de CPA circundante en los dos casos que se muestran aquí, respectivamente. Estas dos concentraciones se seleccionaron para revelar que la tasa de calentamiento en la región profunda del cartílago aumenta al aumentar las concentraciones de nanopartículas en el lado del hueso, lo que guía la futura optimización del protocolo. Los resultados mostraron que la transferencia de calor dentro de la región del cartílago es más eficiente y que la velocidad de calentamiento aumenta con el aumento del nivel de generación de calor en la región ósea OCA (Fig. 6d-i). Por lo tanto, mejorar la distribución de mIONP en las regiones óseas de OCA podría ser un medio factible para mejorar aún más el método de criopreservación sin hielo y nanocalentamiento para la preservación de grandes OCA.

a Esquema de la administración de mIONP a la región ósea de OCA mediante inyección. b Inspección visual de muestras de OCA con y sin inyección de mIONP. La flecha blanca resalta la región de inyección con un color marrón. Vista lateral del hueso BV, vista transversal CV. c Imágenes por resonancia magnética de OCA con y sin inyección de mIONP mediante secuencia de eco de gradiente. La flecha blanca resalta la región de inyección con señales de resonancia magnética disminuidas debido a la presencia de mIONP. Las barras de escala representan 4 mm. d Perfil de temperatura en el plano de sección transversal del sistema modelo después de 83 s de nanocalentamiento cuando la tasa de generación de calor en la región ósea es la mitad de la del CPA que rodea la OCA. \(q\)cartílago y \(q\)hueso son las tasas de generación de calor en la región del cartílago y la región ósea, respectivamente. Los sitios en la superficie del cartílago (CS), 300 µm debajo de la superficie del cartílago (CS@300 µm) y la interfaz cartílago-hueso (CBI) se indican con puntos grises, rojos y amarillos. e Perfil de temperatura en CS, CS@300 µm y CBI que se muestra en (d). f Velocidad de calentamiento en CS, CS@300 µm y CBI derivada del perfil de temperatura presentado en (e). También se presentaron para comparación los resultados de la velocidad de calentamiento del modelado de nanocalentamiento sin inyección de mIONP en la región ósea. \(q\)bone y \(q\) son la tasa de generación de calor en la región del hueso y en la solución de CPA, respectivamente. g Perfil térmico en el plano de sección transversal del sistema modelo después de 83 s de nanocalentamiento cuando la tasa de generación de calor en la región ósea es igual a la del CPA que rodea la OCA. h Perfil de temperatura en el sitio de CS, CS@300 µm y CBI que se muestra en (g). i Velocidad de calentamiento en el sitio de CS, CS@300 µm y CBI derivada del perfil de temperatura presentado en (h). También se presentaron para comparación los resultados de la velocidad de calentamiento del modelado de nanocalentamiento sin inyección de mIONP en la región ósea. \(q\)bone y \(q\) son la tasa de generación de calor en la región del hueso y en la solución de CPA, respectivamente. Nota: Los mIONP del grupo nanowaming se cargan mediante el método de inyección para todos los datos presentados aquí.

Este estudio inicia la criopreservación de OCA grandes. Al incorporar vitrificación y nanocalentamiento, nuestro método permite un recalentamiento de la muestra más rápido en comparación con el calentamiento por convección, reduciendo así el potencial de daño de la muestra debido a la formación de hielo. El análisis cuantitativo de la actividad metabólica de las células de condrocitos del cartílago y la viabilidad celular reveló que nuestro método supera la estrategia de convección tradicional en la preservación de OCA grandes. Las caracterizaciones a nivel de tejido también mostraron que nuestro método no afectó negativamente al material del cartílago ni a las propiedades mecánicas. Estos resultados demuestran la viabilidad de este método de criopreservación sin hielo y nanocalentamiento para la criopreservación de OCA de gran tamaño.

La criopreservación de OCA a largo plazo es fundamental para mejorar la utilización de OCA de los donantes y aliviar la escasez de OCA. Los estudios actuales sobre la conservación del cartílago se centran principalmente en el proceso de vitrificación. Se han propuesto diferentes protocolos de vitrificación con diversas soluciones de CPA, tiempos y pasos de carga y temperaturas de carga24,25,26,45,46. Sin embargo, el procedimiento de calentamiento no ha sido bien investigado. El uso de un baño de agua tibia es el estándar actual para el recalentamiento de muestras. En el caso de la criopreservación con OCA pequeña, el proceso de calentamiento es menos crítico para el éxito de la conservación del cartílago, ya que el calentamiento por convección es suficiente para un recalentamiento rápido. Sin embargo, con muestras más grandes, el recalentamiento se vuelve más desafiante debido a las limitaciones de la transferencia de calor. Se ha informado que la velocidad de calentamiento cae cuando el tamaño de la muestra (tejido más soluciones circundantes) excede los 10 mm de diámetro28. Sin nuevos protocolos o estrategias, es imposible cumplir con el requisito de velocidad de calentamiento para el recalentamiento de muestras vitrificadas de gran tamaño empleando el método tradicional de calentamiento por convección. Nuestro método incorpora nanocalentamiento y vitrificación, lo que proporciona un medio viable para resolver los problemas de calentamiento. Nuestros datos revelaron la incapacidad del método de convección tradicional para la conservación de OCA grandes y mostraron que es necesario mejorar la velocidad de calentamiento para lograr la criopreservación de cartílagos grandes. Nuestros hallazgos están alineados con un informe bibliográfico reciente47. En este estudio de la literatura anterior, las soluciones de CPA que rodean el cóndilo se agotaron, lo que permitió una transferencia de calor más rápida debido al contacto directo entre el cartílago y el baño de agua47. Por el contrario, en nuestro método de nanocalentamiento, los CPA circundantes permanecieron y se calentaron rápidamente mediante nanocalentamiento para lograr una rápida transferencia de calor y una velocidad de calentamiento elevada. En comparación con el método de agotamiento de CPA en la literatura, el nanocalentamiento tiene menos posibilidades de generar un gradiente térmico significativo a través de las muestras, ya que la superficie de la muestra no se calienta inmediatamente a una temperatura alta y es flexible para mejorar la eficiencia del calentamiento mediante la entrega de nanopartículas a la región ósea. como se muestra aquí (Fig. 6). Además, retener la solución de CPA circundante podría ayudar a aislar el OCA, evitando así que los OCA tengan contacto directo con otras superficies y evitando potencialmente daños durante el almacenamiento o el transporte. Una evaluación integral del nivel de células y tejidos ha demostrado los beneficios de nuestro método sobre el método de convección. Existe una gran necesidad clínica de criopreservación con OCA de gran tamaño para ayudar en la planificación quirúrgica al proporcionar tiempo adicional para la compatibilidad y el cribado entre donante y receptor. Además, en comparación con las OCA pequeñas, las OCA grandes y preservadas brindan la flexibilidad de recolectar injertos de cualquier tamaño y forma para adaptarse al sitio del defecto del paciente en el momento de la operación.

El nanocalentamiento es una técnica prometedora para la conservación de órganos y tejidos grandes. En este estudio, demostramos la aplicación de nanocalentamiento para la preservación de OCA porcinos con un volumen de tejido de aproximadamente 9 ml (un volumen total de ~39 ml, incluidos los 30 ml de CPA circundantes), que es mucho más grande que los tejidos y órganos utilizados anteriormente. reportado en la literatura30,31,32,38. Se ha aplicado nanocalentamiento para preservar arterias y válvulas cardíacas porcinas, corazones y riñones de ratas; Los corazones y riñones de rata tienen volúmenes relativamente pequeños, ≤1 ml, mientras que las arterias y las válvulas cardíacas porcinas son delgadas. Sin lugar a dudas, estos informes bibliográficos han introducido con éxito el concepto de nanocalentamiento y han demostrado la capacidad del nanocalentamiento para la conservación de muestras biológicas, especialmente órganos complejos como el corazón y los riñones. Sin embargo, aún no se ha demostrado la función de ampliación del nanocalentamiento para la conservación de tejidos y órganos de gran tamaño. Aquí, implementamos nanocalentamiento con una gran porción de tejido biológico y evaluamos sistemáticamente el resultado del nanocalentamiento para la preservación de tejidos grandes, trasladando la técnica de nanocalentamiento a la práctica clínica. Además, el cartílago articular es un tejido denso y no tiene una red de vasos sanguíneos. A diferencia de los sistemas vascularizados como el corazón y el riñón, los mIONP no se pueden distribuir uniformemente dentro del tejido mediante inmersión o perfusión; La inspección visual y las exploraciones por resonancia magnética mostraron que no había mIONP dentro del tejido (Fig. 5a, b y Fig. complementaria 6). Aunque no se pudo lograr un calentamiento uniforme debido a la ausencia de mIONP dentro del cartílago, la solución que rodea el cartílago se puede calentar rápidamente y transferir el calor al cartílago. La velocidad de calentamiento resultante dentro del tejido alcanzó 16,0-38,5 °C min-1, que es mucho más alta que los 6,2-17,6 °C min-1, logrados mediante el calentamiento por convección. La velocidad de calentamiento del nanocalentamiento debe ser lo suficientemente alta para evitar daños al tejido del cartílago durante el proceso de recalentamiento. Esta idea fue respaldada tanto por experimentos in vitro como por resultados de modelos. Nuestros resultados indican que el nanocalentamiento ayuda a preservar mejor el cartílago de las OCA grandes, particularmente en la capa superficial, y que el nanocalentamiento es un enfoque factible para la preservación de tejidos densos y avasculares.

Los resultados de la prueba AlarmarBlue demostraron que el aumento de la concentración de CPA mejoraba drásticamente las actividades metabólicas de los condrocitos para ambos métodos de calentamiento. Una concentración más alta de CPA generalmente reduce las tasas críticas de enfriamiento/calentamiento, reduciendo así la posibilidad de formación de hielo durante los procesos de enfriamiento y calentamiento; esto podría explicar el beneficio observado del CPA de alta concentración (VS83) utilizado en este estudio para la conservación de OCA sobre el CPA de concentración más baja (VS55 y VS70) (Fig. 2a y Fig. complementaria 3). Los resultados de la actividad metabólica celular mostraron una mejor recuperación de la función celular en el grupo de nanocalentamiento que en el grupo de convección (actividad metabólica celular normalizada en el cultivo de tejido del día 3: nanocalentamiento frente a convección en el grupo VS83, 102 ± 14 % frente a 63 ± 12 %, respectivamente). Nuestros resultados de tinción viva/muerta también demostraron que el nanocalentamiento rescató más células vivas que el calentamiento por convección (viabilidad celular: nanocalentamiento frente a convección, 46,1 ± 15,9% frente a 26,4 ± 9,8%, respectivamente). Sin embargo, la viabilidad celular del cartílago nanocalentado fue diferente a la del cartílago fresco. Los resultados de la tinción vivo/muerto mostraron que el cartílago nanocalentado tenía una fluorescencia verde muy alta en la capa superficial del cartílago pero señales verdes tenues en la zona media y profunda del cartílago, mientras que los cartílagos frescos exhibían señales verdes homogéneas en todas las profundidades. Las células en las zonas media y profunda del cartílago nanocalentado no eran tan activas como las células en el cartílago fresco (es decir, con menos enzima para interactuar con la calceína AM para producir una señal de fluorescencia verde). Los diferentes resultados de tinción viva/muerta a diferentes profundidades del cartílago podrían correlacionarse con la tasa de calentamiento dependiente de la profundidad. La capa de cartílago con una mayor velocidad de calentamiento tenía más condrocitos vivos y funcionales. El análisis de viabilidad celular se basó en mediciones inmediatamente después del recalentamiento. Los estudios futuros deberían investigar la viabilidad celular después del cultivo de tejido de cartílago para comparar mejor las diferencias entre el cartílago nanocalentado y el fresco.

El cartílago articular es una mezcla compleja de agua y componentes de la matriz extracelular. Como la conductividad del cartílago y la FCD son propiedades importantes del material del cartílago que regulan los comportamientos electromecánicos, es necesario un análisis cuantitativo para evaluar la eficacia de la criopreservación. La conductividad del cartílago fresco determinada en este estudio concuerda bien con la medida por otros grupos18,48. Un estudio previo ha demostrado que la conductividad del cartílago disminuye después de un almacenamiento hipotérmico de 28 días18. Nuestros resultados no mostraron cambios significativos en la conductividad del cartílago después de la criopreservación con métodos de convección y nanocalentamiento, lo que indica que nuestro método tiene un impacto muy limitado en los comportamientos eléctricos del cartílago. Además, observamos una FCD comparable en cartílago nanocalentado con respecto al cartílago fresco, pero una disminución de la FCD en el cartílago calentado por convección. Este resultado sugiere que el cartílago calentado por convección podría perder su contenido de glicosaminoglicanos y tender a la degradación de la matriz49 y, por lo tanto, no ser adecuado para la implantación.

Pocos estudios han investigado el impacto de la criopreservación sobre las propiedades mecánicas del cartílago. Al realizar pruebas mecánicas locales y de espesor total, nuestros resultados sugirieron cambios dependientes de la profundidad en las propiedades mecánicas del cartílago después de la criopreservación. En la capa superficial del cartílago, el cartílago nanocalentado tiene propiedades mecánicas comparables a las del cartílago fresco. El tamaño de la muestra fue de ~30 mm × 20 mm × 14 mm (largo × ancho × espesor) en nuestro estudio, que fue mucho mayor que los utilizados en informes de literatura anteriores. Kiefer y cols. utilizaron cartílago articular bovino pequeño (6 mm de diámetro, 3 mm de espesor) para investigar el efecto de la criopreservación sobre el comportamiento mecánico y no encontraron cambios significativos después de la criopreservación50. Li y col. También demostraron que el cartílago porcino vitrificado (9 mm de diámetro) tenía propiedades mecánicas comparables al cartílago fresco51. Nuestros resultados con muestras de gran tamaño coincidieron con estos hallazgos de la literatura anterior con muestras pequeñas50,51, lo que indica la capacidad escalable de nuestro método para la criopreservación del cartílago. Sin embargo, el cartílago nanocalentado mostró propiedades mecánicas de espesor total comprometidas, lo que sugiere la necesidad de una mayor optimización del protocolo de nanocalentamiento. Como se muestra en el trabajo de modelado, la entrega de mIONP a la región ósea de los OCA podría ser una posible solución. Los estudios futuros pueden evaluar experimentalmente el desempeño de esta estrategia e investigar métodos relacionados para eliminar los mIONP.

Nuestros resultados de modelado de nanocalentamiento en la superficie del cartílago mostraron algunas diferencias con las mediciones experimentales en momentos posteriores (Fig. 5f). Las discrepancias entre los resultados experimentales y del modelado podrían deberse al uso de propiedades térmicas de CPA independientes de la temperatura en nuestro modelo. Se ha demostrado que los parámetros térmicos del CPA, como el calor específico, la conductividad térmica y la densidad, dependen de la temperatura28,31,32,52,53,54. También se ha informado que la tasa de generación de calor por nanocalentamiento depende de la temperatura31,32,52. Todos estos parámetros podrían afectar las predicciones del modelo y, por lo tanto, deben determinarse experimentalmente. En nuestro estudio, se construyó un modelo simplificado y se aplicaron las propiedades térmicas de CPA promediadas como se utilizaron en un informe anterior30,55. Utilizando este modelo simplificado, podemos revelar posibles causas de nuestras observaciones experimentales de preservación dependientes de la profundidad e insinuar medios potenciales para mejorar aún más el resultado de preservación de OCA. Sin duda, se necesitan estudios futuros para construir un modelo más completo que represente el nanocalentamiento real con la muestra de OCA. Dada la limitación de datos sobre las propiedades térmicas del VS83, también será fundamental establecer la base de datos de diferentes propiedades térmicas de CPA en el campo de la criopreservación.

En este estudio, nos centramos principalmente en el proceso de calentamiento. Sin embargo, múltiples factores afectan los resultados de la criopreservación, incluidos diversos entornos para los pasos de enfriamiento y calentamiento. Los estudios futuros pueden incorporar los últimos avances en criopreservación para mejorar la carga de CPA y reducir la toxicidad de CPA para mejorar aún más los resultados de la criopreservación. Por ejemplo, agregar aditivos a las soluciones de CPA puede mejorar aún más los resultados, ya que se ha demostrado que los aditivos, el sulfato de condroitina y el ácido ascórbico, mitigan la toxicidad de las altas concentraciones de crioprotector26. Además, el protocolo de nanocalentamiento también se puede ajustar aún más con la ayuda de modelos computacionales y técnicas de fabricación avanzadas para crear nanopartículas generadoras de calor más estables, biocompatibles y eficientes31,39,45.

Con una mayor optimización del protocolo de nanocalentamiento, este método de biobanco para la preservación del cartílago mejorará en gran medida la utilización del suministro limitado de aloinjertos, aumentará la supervivencia a largo plazo del aloinjerto in vivo y ampliará las aplicaciones clínicas del trasplante de aloinjerto osteocondral.

Se obtuvieron trócleas femorales frescas de cerdos cruzados de Yorkshire domésticos sexualmente maduros (de sexo mixto) (de 4 a 6 meses de edad) de un matadero local y se utilizaron para el procedimiento de conservación aproximadamente 4 h post-mortem. El uso de tejidos animales está aprobado por la Universidad de Clemson y la Universidad Médica de Carolina del Sur. No se sacrificó ningún animal específicamente para este estudio. Se recolectaron aloinjertos osteocondrales (OCA) de la tróclea femoral (largo × ancho × espesor, ~30 mm × 20 mm × 14 mm), que representan ~25% de la tróclea (Fig. 1a) y se colocaron en vasos estériles que contenían Dulbecco frío. Medio de Eagle modificado (DMEM; Corning, Arizona) suplementado con 100 UI por ml de penicilina y 100 μg ml-1 de estreptomicina (Millipore Sigma, MO). Luego se separaron aleatoriamente en tres grupos: frescos, vitrificación con calentamiento por convección y vitrificación con nanocalentamiento.

En este estudio se probaron tres soluciones de vitrificación diferentes: VS55 de uso común (DMSO 3,10 M, formamida 3,10 M y 1,2-propanodiol 2,21 M), nuestro VS83 recientemente desarrollado (DMSO 4,65 M, formamida 4,65 M y 3,31 M 1, 2-propanodiol)25, y VS70 (DMSO 3,97 M, formamida 3,97 M y 1,2-propanodiol 2,83 M), una solución de CPA con una concentración entre VS55 y VS83. Las OCA se infiltraron gradualmente con VS83, VS70 o VS55 en solución EuroCollins a 4 °C. Las soluciones de vitrificación diluidas preenfriadas se agregaron en seis pasos secuenciales de 20 minutos de concentración creciente (0%, 18,5%, 25%, 50%, 75% y 100%) en hielo (Fig. 1b). Luego, cada muestra se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 30 ml de soluciones de vitrificación al 100 % preenfriadas (4 °C) con o sin 2 mg de Fe por ml (Ferrotec, EMG-308) para los grupos de nanocalentamiento y convección, respectivamente. Luego, todas las muestras se colocaron inmediatamente en un baño de 2-metibutano preenfriado a -135 °C y se vitrificaron25. Las muestras se almacenaron a -135 °C en un congelador mecánico durante al menos una semana antes de recalentarlas. El protocolo de carga de mIONP en el grupo de nanocalentamiento descrito aquí se definió como un método de carga por inmersión, ya que los OCA cargados con CPA se transfirieron al CPA con mIONP y luego se vitrificaron inmediatamente.

Los OCA vitrificados en el grupo de calentamiento por convección se calentaron colocando el recipiente de plástico con las muestras en un baño de agua a 37 °C. Después del recalentamiento, la solución de vitrificación se eliminó en siete pasos secuenciales de 20 minutos a 0 °C en el medio de cultivo DMEM.

Los OCA vitrificados en el grupo de nanocalentamiento se calentaron en ~ 80 s utilizando una fuente de alimentación de inducción de estado sólido EASYHEAT 5060LI, terminal de 5,0 kW y 230 kHz, con un cabezal de trabajo remoto y una bobina helicoidal de múltiples vueltas personalizada con 6 a 7 vueltas para crear un 35 kA m−1 campo magnético en el centro. Después del recalentamiento, los mIONP y la solución de vitrificación se lavaron de manera gradual similar a la descrita para las muestras en el grupo de calentamiento por convección.

Las curvas de temperatura-tiempo en los procesos de enfriamiento y calentamiento se midieron mediante un acondicionador de señal de fibra óptica (FOTEMP1-H, Micronor INC, Camarillo, CA) junto con un sensor de temperatura de fibra óptica (TS3, Micronor INC, Camarillo, CA). Para la medición de temperatura en las soluciones de CPA (tanto VS55 como VS83), el sensor de temperatura de fibra óptica estaba bien asegurado a lo largo del eje del tubo Falcon de 50 ml (Figura complementaria 2a). La punta del sensor se colocó en el medio de las soluciones de CPA llenas para determinar el perfil de temperatura en el centro de la solución de CPA (Figura complementaria 2a). Para la medición de la temperatura en la superficie del cartílago de los OCA sumergidos en el VS83 con/sin mIONP (para calentamiento por convección y nanocalentamiento, respectivamente), la punta del sensor estaba bien posicionada en el centro de la superficie del cartílago. La curva de temperatura de enfriamiento se midió mientras las muestras (soluciones puras de CPA u OCA en VS83) se vitrificaban siguiendo el procedimiento de enfriamiento. La velocidad de enfriamiento se calculó como la primera derivada de la curva temperatura-tiempo en cada punto de tiempo. Para la curva de temperatura de calentamiento, el aumento de temperatura se registró durante el proceso de calentamiento por convección y nanocalentamiento. La velocidad de calentamiento se determinó como la velocidad de calentamiento media (es decir, la cantidad de aumento de temperatura dividida por el tiempo) de los primeros 10 a 60 s de datos de temperatura.

Después del proceso de recalentamiento, se recogieron OCA para la prueba de actividad metabólica celular. Primero se eliminó el lado óseo de la OCA. Luego, las muestras de cartílago articular restantes se cortaron en trozos pequeños y se incubaron en 2 ml de DMEM durante una hora para equilibrarlas, seguido de la adición de 10 % de alamarBlue (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) en condiciones estándar de cultivo celular durante 3 h. La cantidad de fluorescencia de cada pieza de cartílago se midió en 12 a 24 duplicados mediante el lector de microplacas multimodo a una longitud de onda de excitación de 544 nm y una longitud de onda de emisión de 590 nm. Como alamarBlue no es citotóxico, se cultivaron muestras de cartílago de los grupos de convección y nanocalentamiento en el medio durante 3 días y se realizaron las mismas mediciones de fluorescencia diariamente para permitir la caracterización de los cambios en la actividad celular a lo largo del tiempo. Después de leer la fluorescencia final, las muestras de cartílago se secaron y pesaron. La lectura de fluorescencia promedio de las muestras en blanco (solo solución de alamarBlue sin muestras de cartílago) se restó de la lectura de fluorescencia de cada pieza de cartílago y luego se dividió por el peso seco del cartílago para obtener unidades fluorescentes relativas por mg de tejido seco. Los resultados de los grupos de convección y nanocalentamiento se normalizaron con los resultados medidos en cartílago fresco el día 0 para obtener porcentajes.

La viabilidad celular se examinó mediante tinción fluorescente viva/muerta. Se cortaron manualmente tiras de cartílago de espesor total de las muestras de cartílago con una hoja de afeitar y se sumergieron en medio de cultivo DMEM con calceína AM 2 µM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y homodímero-1 de etidio 4 µM (Thermo Fisher Scientific, Waltham). , MA) a temperatura ambiente durante 1 h antes de la obtención de imágenes. La calceína AM es permeable a la membrana celular e interactúa con las esterasas citoplasmáticas en las células vivas para generar una señal de fluorescencia verde. El homodímero-1 de etidio, en cambio, es impermeable a la membrana, ingresa a las células muertas con membranas celulares dañadas y se une al ácido nuclear para producir una señal de fluorescencia roja. Luego, las tiras de cartílago teñidas se colocaron en una placa de Petri con fondo de vidrio con su lado transversal sobre el vidrio. Para obtener imágenes se utilizó un microscopio de barrido láser multifotónico Olympus FV1200MPE invertido (Olympus, Center Valley, PA) con una lente de × 10. La longitud de onda de excitación fue de 800 nm56. La señal de fluorescencia verde se recopiló dentro del rango de 495 a 540 nm, mientras que la señal de fluorescencia roja se recolectó en el rango de 575 a 630 nm. Se tomaron imágenes de cortes transversales a una profundidad de 100 µm por debajo de la superficie del tejido. Después de las imágenes de fluorescencia, se cuantificó la viabilidad celular en la capa superficial del cartílago (dentro de ~400 µm de la superficie del cartílago) utilizando ImageJ (V1.52a, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). La intensidad de las señales de fluorescencia de los canales verde y rojo se utiliza para diferenciar entre células vivas y muertas. Las células con mayor intensidad de fluorescencia verde se contaron como células vivas, mientras que las células con mayor intensidad de fluorescencia roja se contaron como células muertas. La viabilidad celular se definió como la relación entre el número de células vivas y el número total de células (número de células vivas más número de células muertas).

Los tapones osteocondrales recolectados de los tres grupos experimentales (fresco, convección y nanocalentamiento) se fijaron en una solución de formalina al 10%, se deshidrataron y luego se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones de 5 µm utilizando un micrótomo y se procesaron para la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y la tinción con safranina O. Se adquirieron imágenes de campo brillante con objetivos × 4 y × 10 en un microscopio Olympus BX40 (Olympus, Center Valley, PA).

Se utilizó un aparato de conductividad personalizado (Fig. 3a) para examinar la conductividad eléctrica del tejido y determinar la densidad de carga fija (FCD) del cartílago43,44,57. La cámara de conductividad consta de electrodos de medición de voltaje y fuente de corriente colocados alrededor de una cámara de plexiglás que contiene cada muestra. Empleando un medidor de fuente Keithley (modelo 2400, Keithley Instruments, Inc., Cleveland, OH), se determinó la resistencia (R) a través de la muestra a una densidad de corriente muy baja de 0,015 mA cm-2. La conductividad eléctrica correspondiente (\(\chi\)) se calculó utilizando la siguiente ecuación:

donde \(h\) y \({A}\) son la altura y el área de la sección transversal de la muestra, respectivamente. El espesor de la muestra, \(h\), se midió usando un micrómetro de detección de corriente inmediatamente antes de la medición de la conductividad. La FCD se determinó mediante un método de conductividad eléctrica de dos puntos. Las muestras de cartílago se perforaron en tapones cilíndricos de 5 mm con un trépano y se recortaron en ambos lados para garantizar que la superficie fuera plana utilizando un micrótomo. Luego, las muestras se sumergieron en una solución isotónica de KCl (0,15 M) durante 12 h a 4 °C mientras se confinaban axialmente entre dos placas porosas de polietileno hidrófilo (50–90 µm; Small Parts, Inc., Miami Lakes, FL) en un diámetro de 5 mm. cámara. Después de la incubación, se midió la conductividad eléctrica del cartílago (\({\chi }_{{{\rm {Iso}}}}\)). Inmediatamente después de la medición en una solución isotónica, las muestras se incubaron en una solución hipotónica de KCl (0,03 M) durante 12 h y se midió nuevamente la conductividad del cartílago (\({\chi }_{{{\rm {Hypo}}}}\)). . Luego se determinó la FCD de la muestra (\({c}^{{\rm {F}}}\)) mediante las dos conductividades medidas en condiciones isotónicas e hipotónicas43,44:

donde \({c}_{{{\rm {Iso}}}}^{* }\) y \({c}_{{{\rm {Hypo}}}}^{* }\) son los concentraciones de iones de las soluciones isotónicas e hipotónicas de KCl, respectivamente. Todas las mediciones de conductividad eléctrica se realizaron a temperatura ambiente (22 °C).

La porosidad de la muestra de cartílago se midió utilizando el método de flotabilidad. Inmediatamente antes de la incubación de la muestra en una solución isotónica, el peso de la muestra se registró en aire (\({W}_{{{\rm {húmedo}}}}\)) y en solución salina tamponada con fosfato (\({W}_{ {{\rm {PBS}}}}\)) utilizando un kit de determinación de densidad y una balanza analítica (Sartorius YDK01, Alemania). Inmediatamente después de la medición de la conductividad en condiciones hipotónicas, las muestras se liofilizaron y se registró el peso seco (\({W}_{{{\rm {seco}}}}\)). La porosidad (\({\phi }^{{\rm {W}}}\)) se determinó mediante:

donde \({\rho }_{{{\rm {PBS}}}}\) y \({\rho }_{{\rm {w}}}\) son la densidad de la solución de PBS y el agua, respectivamente.

Las pruebas de microindentación se realizaron utilizando un sistema de bioindentación (UNHT3 Bio, Anton Paar, Suiza) (Fig. 4a). La resolución para la fuerza y ​​el desplazamiento se redujo a 0,001 µN y 0,006 nm, respectivamente. En el centro de cada muestra individual se extrajo un tapón osteocondral de 5 mm de diámetro. Se realizaron cuatro mediciones de espesor equiespaciadas utilizando un estereoscopio calibrado, y el valor promedio se definió como el espesor del cartílago. Después de la medición del espesor, los tapones osteocondrales se montaron perpendicularmente en el soporte de la muestra con el extremo del hueso cuidadosamente pegado a una placa de Petri utilizando una pequeña cantidad de cianoacrilato. Luego se añadió solución de PBS para sumergir completamente la muestra. El portamuestras estaba bien colocado para garantizar que el penetrador estuviera perpendicular a la superficie del cartílago. Para la prueba se utilizó un penetrador de bola de rubí esférico (1 mm de diámetro). Al inicio de la prueba de fluencia, se aplicó una carga de tara de 0,05 mN y se mantuvo durante 600 s, seguida de una carga escalonada de 5 mN durante 800 s para generar los datos de fluencia. Los datos de fuerza de indentación y desplazamiento se adquirieron a 20 Hz. Se realizaron de dos a tres pruebas de indentación con una separación de aproximadamente 500 µm en la región central de cada muestra. Los datos de fluencia se analizaron con la teoría biofísica de Hertz para obtener el módulo de contacto de equilibrio y la permeabilidad hidráulica en la superficie del cartílago58.

Las pruebas mecánicas de compresión confinada con muestras de cartílago se realizaron con un analizador mecánico dinámico (DMA Q800, TA Instruments, Delaware, EE. UU.) (Fig. 4d). La precisión para las mediciones de fuerza y ​​desplazamiento fue de 0,1 mN y 0,1 µm, respectivamente. Las muestras de cartílago para las pruebas mecánicas se perforaron primero en un tapón cilíndrico de 5 mm con un trépano y se recortaron con un micrótomo. Luego, se comprimieron axialmente muestras de cartílago de 5 mm entre una sonda de prueba (5 mm de diámetro) en la parte superior y una placa permeable porosa rígida (~20 µm) en la parte inferior. Primero se comprimieron las muestras con una carga de tara (0,05 N) para asegurar el contacto entre la muestra y la sonda de prueba y medir la altura inicial de la muestra. Luego se añadió cuidadosamente PBS a la cámara y se aplicó una tensión de compresión del 10% (en relación con la altura inicial). Se permitió que las muestras alcanzaran el equilibrio (~1 h) y se registró la tensión de equilibrio. Utilizando la teoría bifásica59, el módulo de compresión del agregado en equilibrio y el coeficiente de permeabilidad hidráulica se determinaron ajustando la curva de relajación de tensiones.

Primero se sumergieron OCA frescas en soluciones VS83 sin mIONP durante 2 h y luego se incubaron en soluciones VS83 con 2 mg ml-1 mIONP durante diferentes períodos de tiempo (3 min, durante la noche y 2 días) antes de las exploraciones por resonancia magnética. Como grupo de control se utilizaron OCA sumergidos en soluciones VS83 sin mIONP. Antes de la exploración por resonancia magnética, se eliminaron el exceso de soluciones de CPA que rodeaban las OCA y las OCA se envolvieron con una envoltura de plástico. Luego se utilizó un escáner de resonancia magnética de 7 T (BioSpec 70/30 USR, Bruker Corp., Ettlingen, Alemania) para escanear las muestras de OCA con secuencia de eco de gradiente y secuencia de eco de espín. Se prepararon geles de agarosa al 1% con diferentes concentraciones de mIONP como fantasmas estándar para mostrar el contraste de resonancia magnética con la presencia de mIONP y se escanearon con las secuencias idénticas utilizadas para las imágenes OCA. Los ajustes de escaneo para la secuencia de eco de gradiente fueron: tiempo de repetición/tiempo de eco (TR/TE) = 200/2,5 ms, ángulo de giro = 30°, campo de visión = 40 mm × 30 mm, tamaño de matriz = 256 × 192, en -resolución del plano = 0,156 mm × 0,156 mm; espesor del corte = 1,0 mm con un espacio de 0,3 mm, tiempo total de escaneo = 1,5 min. El protocolo de escaneo para la secuencia de eco de espín fue: TR/TE = 2000/5 ms, ángulo de giro = 90°, campo de visión = 40 mm × 30 mm, tamaño de matriz = 128 × 128, resolución en el plano = 0,313 mm × 0,234 milímetros; espesor del corte = 1,0 mm con un espacio de 0,3 mm, tiempo total de escaneo = 4,5 min.

El proceso de nanocalentamiento se simuló utilizando el software de análisis de elementos finitos COMSOL (V5.4, COMSOL Inc, Burlington, MA). Se construyeron dos modelos computacionales para simular el nanocalentamiento solo con las soluciones VS83 y el nanocalentamiento con muestras de OCA en las soluciones VS83. El modelo para la solución de nanocalentamiento VS83 se simplificó como un tubo cilíndrico (14 mm × 49 mm, radio × altura) lleno de solución de CPA con mIONP, correspondiente a 30 ml de la solución de CPA utilizada en el experimento real (Figura complementaria 5g). . El modelo computacional para las muestras de OCA consistió en un tubo cilíndrico (14 mm × 63 mm, radio × alto) y el bloque osteocondral (30 mm × 20 mm × 14 mm, largo × ancho × espesor) (Fig. 5c). El espesor del cartílago se definió como 2 mm45. El perfil térmico estuvo regido por la ecuación de transferencia de calor:

donde \(\rho\) es la densidad, \({C}_{{\rm {p}}}\) es el calor específico, \(k\) es la conductividad térmica, \(t\) es la tiempo, \(T\) es la temperatura y \(q\) es la tasa de generación de calor debido al nanocalentamiento. Siguiendo la literatura anterior31,32, en este modelo se utilizaron las propiedades de la solución de CPA en lugar del injerto osteocondral impregnado de CPA. Hay datos térmicos de VS83 muy limitados en la literatura. Como nuestros resultados indicaron que VS83 tiene propiedades térmicas similares a VS55 (Figuras complementarias 5a-f), los parámetros térmicos de la solución VS55 (\(\rho\) = 1100 kg m−3, \({C}_{{\ rm {p}}}\) = 2.1 × 103 J kg−1 K−1, \(k\) = 0.3 W m−1 K−1)30,55 fueron aplicados en este estudio. El término de generación de calor, \(q\), en la OCA se definió como cero debido a la ausencia de nanopartículas (Fig. 5a, b y Fig. complementaria 6). La tasa de generación de calor en la solución de CPA circundante se determinó y validó mediante experimentos de nanocalentamiento con soluciones de CPA con mIONP. Se supuso que la condición de contorno del tubo era aislamiento28. Para la simulación de dos casos de nanocalentamiento con nanopartículas administradas a la región ósea de la OCA, la tasa de generación de calor en la región ósea se estableció como la mitad (Fig. 6d-f) o igual (Fig. 6g-i) a la de la solución de CPA circundante. El resto de parámetros se mantuvieron igual que en la simulación anterior. También se modeló el calentamiento por convección. Aunque en este estudio no se determinó el coeficiente de transferencia de calor entre el tubo y el baño de agua tibia, establecimos una temperatura constante de la superficie del tubo, 37 °C (es decir, coeficiente de transferencia de calor infinito), para modelar la velocidad de calentamiento más alta por convección. Todos los modelos utilizan configuraciones de malla extra fina en COMSOL.

Se realizó una prueba t bilateral para evaluar la diferencia en la velocidad de calentamiento entre el calentamiento por convección y el nanocalentamiento. Se utilizó un ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Bonferroni para examinar las diferencias en la viabilidad celular, la conductividad eléctrica, la FCD, la porosidad y las propiedades mecánicas de las muestras de cartílago basadas en imágenes de fluorescencia entre los grupos frescos, de convección y de nanocalentamiento. Dado que se realizaron múltiples mediciones en diferentes ubicaciones de la misma muestra en la prueba de microindentación, la ubicación de la medición se definió como una covariable para el análisis estadístico. Todos los análisis se realizaron en SPSS (IBM SPSS Statistics, Versión 24.0, IBM Corp., Armonk, NY). Se informaron diferencias significativas en p <0,05 con estadísticas descriptivas informadas como media ± desviación estándar.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos brutos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Los datos de origen de las cifras se proporcionan en los Datos complementarios de este documento.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R44AR073136 de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a KGMB, P20GM121342 y R01DE021134 a HY. Este trabajo también fue apoyado por la beca postdoctoral T32 DE017551 de los NIH a RGH y CH, y la subvención K99DE031345 de los NIH a CH. también respaldado en parte por Cell & Molecular Imaging Shared Resource, Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina (P30CA138313), SC COBRE in Oxidants, Redox Balance y Stress Signaling (P20GM103542) y Shared Instrumentation Grant S10OD018113.

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Peng Chen, Shangping Wang, Pengling Ren, R. Glenn Hepfer, Cherice Hill, Yongren Wu, Kelvin GM Brockbank y Hai Yao

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Zhenzhen Chen, Elizabeth D. Greene, Lia H. Campbell y Kelvin GM Brockbank

Departamento de Ortopedia, Universidad Médica de Carolina del Sur, Charleston, SC, EE. UU.

Pengling Ren, Yongren Wu y Hai Yao

Departamento de Ciencias de la Salud Bucal, Universidad Médica de Carolina del Sur, Charleston, SC, EE. UU.

R. Glenn Hepfer, Cherice Hill y Hai Yao

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Kristi Helke

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Xingju Nie y Jens H. Jensen

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El manuscrito fue escrito a través de contribuciones de todos los autores. Todos los autores han dado su aprobación para la versión final del manuscrito. HY, KGMB y PC concibieron la idea y diseñaron los experimentos. PC, SW, ZC, PR, RGH y YW realizaron los experimentos a nivel celular y tisular. ZC, EDG, LHC, PC y SW realizaron los procesos de vitrificación y nanocalentamiento. KLH, PC y SW realizaron el análisis histológico. PC, XN y JHJ realizaron las resonancias magnéticas. PC y HY analizaron los datos. PC y HY redactaron el manuscrito. PC, SW, ZC, CH, KGMB y HY revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Hai Yao.

KGMB, ZC, EDG y LHC son empleados de Tissue Testing Technology LLC. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editora principal: Eve Rogers. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Chen, P., Wang, S., Chen, Z. et al. Nanocalentamiento y criopreservación sin hielo de cartílago articular porcino intacto de gran tamaño. Común Biol 6, 220 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04577-9

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Recibido: 21 de junio de 2022

Aceptado: 10 de febrero de 2023

Publicado: 24 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04577-9

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